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       【摘要】 
       目的对怀地黄［Rehmannia glutinosa f.Yhueichingensis (Chan et Schih)Hsiao，简称RG］多糖和怀山药(Dioscorea opposite Thumb f.Yhueichingensis Hsiao，简称DT)多糖同步提取方法的工艺参数进行了研究。方法选取提取温度、提取液pH、固液比3个因素，以多糖含量作为指标，通过L9(33) 正交实验确定最佳工艺参数。结果怀山药与怀地黄多糖同步提取的最佳工艺参数为：浸提温度65℃，浸提液pH 5.5，固液比为1∶30；浸提液浓缩比为4∶1，沉降剂乙醇添加量5倍于浸提液体积；采用Sevage法去除蛋白质，提取得到的怀山药与怀地黄同步多糖含量及得率可分别为73.68%和12.67%。结论用同步提取法得到的多糖含量及得率优于分步提取。
       【关键词】  怀地黄多糖 怀山药多糖 同步提取 混合多糖
       
       怀山药，又名山芋、菜山药，为薯蓣科多年生缠绕型草本植物，以根茎入药［1］。山药多糖是山药中的主要活性成分。怀地黄具有止血和促进血细胞增殖的药理活性，同时可以通过影响白血球和血小板来抗炎［2］。怀地黄在中医药中被认为是治疗糖尿病的“四大圣药”之一，现代药理研究也证明其具有降血糖的作用［3］。研究表明怀山药多糖与怀地黄多糖同步后对四氧嘧啶导致糖尿病的小鼠具有较好的治疗效果［4］。由于目前天然产物提取往往采用分步提取而忽略大多天然产物多糖需要进行复配才能起到有效的效果，因此对天然产物进行同步提取可以简化提取步骤，提高多糖含量。
       1  材料与仪器
          
       怀地黄（购于河南省焦作市）；怀山药（购于河南省焦作市）；乙醇、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚试剂均为分析纯,浓硫酸为优级纯；SP-2000UV型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂），薄膜蒸发仪（德国Heidolph公司）。
       2  方法
       2.1  怀山药与怀地黄多糖同步提取及怀山药工艺流程
       2.1.1  怀山药与怀地黄多糖同步提取工艺 取一定量怀地黄、怀山药，粉碎至100目，加入30倍水，浸提4 h，离心收集得到第1次浸提液。向药渣中加入20倍水、90℃下、浸提2 h后离心收集得到第2次浸提液，合并两次收集的浸提液，减压浓缩。Sevage法除蛋白，重复两次，乙醇沉淀后，离心回收沉淀，真空干燥得怀山药与怀地黄同步多糖粗品。
       2.1.2  怀山药多糖分步提取工艺［5］取一定量怀山药，粉碎至100目，加入20倍水，纤维素酶加量7.5%，65℃浸提4 h，离心收集得到第1次浸提液。向药渣中加入25倍水、90℃下、浸提2 h后离心收集得到第2次浸提液，合并两次收集的浸提液，减压浓缩。Sevage法除蛋白，重复两次，乙醇沉淀后，离心回收沉淀，真空干燥得怀山药多糖粗品。
       2.1.3  怀地黄多糖分步提取工艺［6］ 取一定量怀地黄，粉碎至100目，加入20倍水，纤维素酶加量7.5%，65℃浸提4 h，离心收集得到第1次浸提液。向药渣中加入25倍水、90 ℃下、浸提2 h后离心收集得到第2次浸提液，合并两次收集的浸提液，减压浓缩。Sevage法除蛋白，重复两次，乙醇沉淀后，离心回收沉淀，真空干燥得怀地黄多糖粗品。
       2.2  同步多糖蛋白质脱除方法［7］
       2.2.1  三氯乙酸法［8］（TCA法） 收集100 ml怀地黄与怀山药浸提液，加入100 ml 30％的三氯乙酸溶液，静置，离心，上清液减压浓缩至原液体积1/4，加入5倍于浓缩液体积的95％乙醇，静置，离心，收集沉淀物，分析怀山药与怀地黄多糖含量及得率。
       2.2.2  Sevag法［9］ 收集100 ml怀地黄与怀山药浸提液，加入20 ml的Sevag试剂（氯仿与正丁醇体积比为5∶1的同步液），剧烈振荡30 min，离心，回收上层清液，重复上述步骤，进行第2次蛋白的去除，离心后取上层清液减压浓缩至原液体积1/4，加入5倍于浓缩液体积的95％乙醇，静置，离心，收集沉淀物，分析怀山药与怀地黄多糖含量及得率。
       2.3  浸提液浓缩倍数与乙醇添加量对同步多糖提取得率的影响 称取怀地黄40 g，热水浸提后，3000 r/min离心30 min，收集浸提液3200 ml，各取200 ml采用不同的浓缩倍数和沉降剂（乙醇）添加量进行沉降，3500 r/min离心，收集沉淀物，分析同步多糖得率。
       2.4  正交实验法优选怀山药与怀地黄多糖（1∶1）提取工艺怀山药、怀地黄多糖同步提取中，为了获得最大多糖含量，并结合生产实际，选择提取温度、提取液pH值和固液比3个主要工艺参数作为考察因素，每因素选取3个水平，按L9(33)正交表安排实验，以同步多糖含量作为衡量提取效率的指标，优选最佳工艺参数。为了提高其统计分析的可靠性，每一条件下进行3次重复实验（n=3），测定结果取其平均值供统计分析用。
       2.5  多糖含量与得率的测定方法 苯酚-硫酸法［2］。
       2.5.1  标准曲线的制备 精确称取干燥的无水葡萄糖(105℃干燥至恒重)标准品25.3 mg，于500 ml容量瓶中加蒸馏水定容。分别精确吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8    ml标准液于比色管中，各加蒸馏水至2.0 ml，以蒸馏水为空白对照做3组平行实验，再分别加入6%苯酚溶液1.0 ml、浓硫酸5 ml，迅速振荡均匀，室温显色40 min。另取1 ml蒸馏水，加入等量苯酚溶液和浓硫酸，作为空白对照，将上述试样置于SP-2000UV型紫外可见分光光度计中，于最大吸收波长490 nm处测定吸收度,以吸收度（Y）为纵坐标，对葡萄糖含量（X）为横坐标，绘制葡萄糖含量的标准工作曲线。见图1。 
       
       如图1所示，经回归分析，得到回归方程Y = 1.126X-0.004，在葡萄糖浓度0.025～0.02 mg/ml范围内呈线性关系，R2=0.997。
       2.5.2  供试液怀地黄与怀山药同步多糖含量测定取适量的多糖供试液，分别加入6%苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸5 ml，迅速振荡均匀,室温显色40 min，测定各供试液吸收值，利用回归方程求得供试液中葡萄糖的含量。按下式计算样品中多糖含量：
       
       多糖含量（%）=C×DW
       
       C为样品液中葡萄糖的浓度（mg·ml-1）；D为供试液的稀释因素；W为供试样品重量（mg）。
       2.5.3  怀山药与怀地黄同步多糖得率的测定：
       
       多糖得率（%）=所得粗品多糖重量（g）×多糖含量（%）原料重量（g）×100%
       图1  葡萄糖标准曲线（略）
       3  结果
       3.1  同步多糖蛋白质脱除方法的优选 蛋白质具有和多糖相似的溶解性，采用水提醇沉等方法所得的多糖中常存在一定量的蛋白质。常用的脱蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、酶法脱蛋白等。图2是Sevage法、TCA法同步多糖提取过程中同步多糖含量及得率的影响结果。由图2可知，经Sevage法脱蛋白处理后同步多糖的含量和得率可分别达到60.26％和8.97％；明显高于TCA法，从而选择Sevage法除蛋白。
       图2  不同蛋白质去除法对同步多糖的影响（略）
       3.2  浸提液浓缩倍数与乙醇添加量对多糖提取的影响乙醇是常用的多糖沉降剂。浸提液浓缩倍数（浓缩比）和乙醇添加量是影响多糖沉降的关键因素，对RGP的得率有较大的影响，结果（见表1）。由表1可知，浸提液浓缩比为4∶1时，同步多糖得率达到最高，为10.51％，这说明浓缩后浸提液过稀和过稠都不利于多糖沉降。此外， 同步多糖得率达到最高时乙醇添加量为浓缩液的5倍量，说明尽管沉降剂乙醇可降低多糖溶解度促进沉降，但过高的乙醇添加量又会增加溶液总体积而对沉降产生不利影响。
       表1  浓缩比及乙醇加量对多糖得率的影响（略）
       3.3  正交实验法优选怀山药多糖与怀地黄多糖同步提取工艺条件表2～4的正交实验结果表明因素C（提取温度）对怀地黄与怀山药同步多糖的提取有显著影响，而因素A（pH值）、B（料液比）对提取无显著影响。由极差R得出影响因素大小顺序为：C>B>A。最佳提取工艺参数为A1B3C2，即在DEET法提取怀地黄多糖时的最佳工艺参数是：pH值5.5，加酶量7.5 %，温度65℃，固液比为1∶30。依据上述最佳工艺A1B3C2进行重复实验（n=3）进行验证,怀地黄多糖平均含量为73.68 %。
       表2  因素水平（略）
       表3  L9(34)正交实验分析（略）
       3.4  同步提取多糖与分步提取多糖的比较同步提取时，选用怀山药与怀地黄各10 g进行水提法提取；分步提取则各取怀山药、怀地黄10 g分别采用双酶法进行提取，计算提取后多糖得率与多糖含量，并对分步提取后的多糖进行混合复配，计算其多糖含量，并与同步提取法所得多糖含量进行对比，分别进行3次平行实验。结果见表5。
       表4  方差分析（略）
       
       *表示具有明显效果项
       表5  多糖同步提取与单一水提法提取多糖含量对比（略）
       分步提取采用双酶法；同步提取采用水提法
        
       怀山药与怀地黄同步提取所得多糖含量与得率相比酶法分步提取怀地黄、怀山药多糖，其多糖得率与含量略有提高。
       4  讨论
          
       传统的从天然产物中提取多糖是对单一产品进行提取，而本实验中是对怀山药和怀地黄单独进行提取的基础上，将两种材料同步后进行提取，开创了多糖提取的新思路。
       
       同样量的怀山药和怀地黄同步提取相比两种材料单独提取，得到的多糖得率和多糖含量均有很大的提高。由于后续的继续纯化成本较高，该方法不仅提高了中药材的利用率，为后续纯化降低了成本。
       
       作为目前中药研究中，只针对单一中药成分进行研究，而往往忽略中药处方药为多种中药同步。本实验为将来进行处方药有效成分的提取进行初步的研究。
       
       本论文采用双酶法进行分步提取进行对照，而双酶法提取是目前研究单一天然产物提取中得到多糖含量较高的一种方法，常规提取方式为水提法［8］。目前本实验室所得水提法的怀地黄多糖与怀山药多糖的多糖含量分别为：40.17%和34.21%［10］。远远低于同步提取所得多糖含量。
       
       同步提取可以简化天然产物提取工艺，并且其提取后所得多糖含量要略高于双酶法分步提取天然产物多糖含量之和，节省了酶制剂的用量，降低了生产难度，简化了生产工艺，从而降低了天然产物有效成分生产成本。
       
       研究发现怀山药与怀地黄多糖同步提取后，颜色较怀地黄多糖提取后较浅，并形成了外层为褐色中间为白色的物质结构。推测可能是多糖提取过程中，色素脱离并再次沉降附着在所提取多糖表面上。
       
       本实验所得同步多糖的样品与多糖单一提取后所得多糖的粘性要远小于怀地黄多糖的粘度，造成这种差异的原因有待进一步研究。
       【参考文献】
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