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       【摘要】 
       目的明确健脾养阴活血法对胃癌前病变p16，c-myc蛋白影响,并探讨影响机理。方法将大鼠分为正常组、模型组、维酶素组和中药治疗组,取材做病理检查及免疫组化检验。结果中药组与模型组及维酶素组均有统计学意义;维酶素组在部分标准下与模型组有统计学意义。结论以健脾养阴活血法为指导的中药方剂能增强抑癌基因p16的表达,同时使原癌基因c-myc的表达减弱;抑癌基因p16的表达增强和原癌基因c-myc的表达减弱是健脾养阴活血法组方有效治疗胃癌前病变机制之一。
       【关键词】  健脾养阴活血法 胃癌前病变 p16 c-myc
       我国胃癌发生率在各类恶性肿瘤中位居第二,病死率居各类恶性肿瘤之首,在老年人群中胃癌的病死率有增加的趋势［1］。胃癌是由癌前病变即慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生逐步发展形成的［2］。胃癌前病变(PLGC)是病理学概念,是指更容易发生癌变的组织病理变化。中医采用整体调理与个体化用药相结合,不仅能改善症状,而且对癌前病变会部分逆转,但机理并不明确。本实验研究健脾养阴活血法对胃癌前病变p16，c-myc蛋白的影响，并对其机理进行初步探讨。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康、性成熟的雄性SD大鼠(由长春高新医学动物实验研究中心提供),体重170～180 g共40只,验动物生产许可证号SCXK(吉)2003-0004。
       1.2  药物中药试剂,成分为黄芪、焦白术、沙参、百合、枳壳、紫苏、甘草、莪术、佛手、三棱、焦三仙、赤芍,由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制成冲剂;维霉素片,河北环海药业有限公司产品,批号为20070611；脱氧胆酸钠,为北京奥博星生物技术有限责任公司产品,批号为20070815；无水乙醇,为长春市化学试剂厂产品,批号为20070322；一抗p16及c-myc试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供；二抗免疫组化检测试剂:由武汉博士德生物工程有限公司提供；DAB显色剂:由北京中山金桥生物技术有限公司提供。
       1.3  器材高速离心机(Hitachi Himac1R21型,日本);电热恒温水浴箱(HH.W21.Cu 600型,上海); 光学显微镜(Olympus BX60型,日本); 轮转式组织切片机(莱佧2135型,德国)。
       2  方法
       2.1  分组方法将120只SD雄性大鼠随机分为4组,正常对照组20只,模型组30只,维酶素组35只,中药治疗组35只;在相同条件下分笼饲养,除正常对照组外其余动物进行造膜。
       2.2  造模方法恒温（24±1）℃,湿度50%～60%。造模用时间共13周。模型组第1～5周自由饮用20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液(每天现配)；第6～13周每隔3 d轮换1次，分别自由饮用20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液和15%乙醇溶液;同时前5周每5天，后8周每7天按10 ml/kg剂量，用150 g/L 75℃ NaCl溶液加室温无水乙醇配制成60%的乙醇溶液，水浴恒温55℃后灌胃;配合饥饱失常法即1～8周：两天饱食、一天禁食；9～13周：两天饱食、一天禁食、水。
       2.3  治疗方法中药治疗组和维酶素组在造模结束后中,中药组用制好的冲剂,配成0.1 g/ml的混悬液以10 ml/（kg·d）灌胃，1次/d；维酶素组将维酶素片研碎制成0. 1 g/ml的混悬液以10 ml/（kg·d）灌胃，1次/d；两用药组用药时间均为12周。
       2.4  标本采集方法实验进行至预定阶段,大鼠禁食、水24 h后处死,距贲门和幽门1.5 cm离断取出全胃并沿胃大弯侧剖开,用冰生理盐水冲洗,滤纸吸干铺开后,取小弯处2～3 mm长条形胃黏膜。常规石蜡包埋,连续切片,2张做免疫组化染色,1张做HE染色作病理组织学检验。
       2.5  指标评定标准病理检验评定标准参照2006年上海会议的《中国慢性胃炎共识意见》进行诊断及分类,并分等级如下:非肠化及异型增生(-);肠化(+);轻度异型增生(++);重度异型增生(+++)。其中将非肠化及异型增生(-)和肠化(+)归类为非强阳性;将轻度异型增生(++)和重度异型增生(+++)归类为强阳性。
       
       免疫组化的判断标准参照文献［3］制定。将染色强度打分：0分为无色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。(染色深浅需与背景着色相对比)。再将阳性细胞所占的百分比打分:0分为阴性；1分为阳性细胞＜10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为>75%。染色强度与阳性细胞百分比乘积进行计分,大于3分为免疫反应(+)。
       2.6  统计学方法应用SPSS15.0统计软件对数据进行分析;计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。
       3  结果
       3.1  病理检验结果见表1。
       表1  各组大鼠的病理检验结果（略）
       阴性与阳性的计数对比：中药治疗组和维酶素组分别与模型组进行比较均有统计学意义,且中药治疗组和维酶素组比较，中药治疗组亦优于维酶素组,差异有显著性意义。见表2。
       表2  各组大鼠病理检验结果阴性与阳性的计数对比（略）
       与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01;与维酶素组比较，cP<0.05
       
       非强阳性与强阳性的计数对比:中药治疗组与模型组进行比较时有统计学意义;维酶素组与模型组进行比较时无统计学意义；中药治疗组与维酶素组进行比较有统计学意义。见表3。
       表3  各组大鼠病理检验结果非强阳性与强阳性的计数对比（略）
       与模型组比较，aP>0.05，bP<0.01; 与维酶素组比较，cP<0.05
       3.2  免疫组化检验结果在综合计分后,乘积大于3分为免疫反应(+)作为标准时，中药治疗组与模型组进行比较时有统计学意义;维酶素组与模型组进行比较时无统计学意义；中药治疗组与维酶素组进行比较有统计学意义。见表4。
       表4  p16，c-myc免疫组化检验结果阴性与阳性的计数对比（略）
       与模型组比较，aP>0.05，bP<0.01；与维酶素组比较，cP<0.05
       
       综合计分后对积分的均数进行组间比较: 中药治疗组和维酶素组分别与模型组进行比较均有统计学意义,且在中药治疗组和维酶素组的比较中,中药治疗组亦优于维酶素组,差异有显著性意义。见表5。
       表5  p16，c-myc免疫组化检验结果积分均数的组间比较（略）
       与模型组比较，aP>0.05，bP<0.01；与维酶素组比较，cP<0.05
       3  讨论
          
       胃癌是一种常见的恶性肿瘤,是许多癌基因、抑癌基因经过多阶段、多途径协同作用,逐步发展形成的。在正常胃粘膜到癌前病变过程以及癌前病变至胃癌过程中,存在特异的基因差异表达,目前已发现多种胃癌相关基因［3］。p16蛋白是多重肿瘤抑制基因1(MTS1)编码产物,MTS1在1994年首次由美国报道,此基因位于人类染色体9p21,基因长度为23kb,含3个外显子,编码产物为pl6,p16基因座编码两不同的翻译产物,它是正常细胞周期的调控者之一,具有负性调节细胞周期的作用［4］。一旦p16基因发生突变或缺失,p16蛋白也随之失活或缺失,细胞不断增殖, DNA甲基化是p16基因失活的一个重要机制［5］。c-myc是一个多功能的癌基因,位于人类染色体8p24上,有转录因子活性,可以启动细胞增殖、抑制细胞分化、调节细胞周期并参与细胞凋亡的调控,具有促进增殖和诱导凋亡的双重作用;是在细胞恶性化过程中较早出现的分子改变,与肿瘤启动和恶性增生密切相关［6］。能和靶DNA调控序列(如Inr序列)特异结合从而对细胞内基因表达进行直接调控［7］。最近研究指出,c-myc基因导致细胞生长、癌变的重要机制也可能和刺激rRNA的合成、堆积有关［8］。在治疗胃癌前期病变中,应“治病求本”,补益脾胃之气。李东垣指出：“善治者,唯有调和脾胃。”这是逆转胃癌前期病变的关键,故以健脾为首。胃癌前病变是长时间迁延过和,久病伤津耗液、瘀阻脉络，故辅以养阴活血。我们的研究显示中药在有效治疗胃癌前病时，p16的表达增强，c-myc的表达减弱,这说明中药对胃癌前病的较好疗效是通过作用于多基因而实现的，其对p16，c-myc表达的调节可能是其作用机制之一。
       
       维酶素在治疗胃癌前病变时有一定的作用,但在病变较重时疗效不佳。以健脾养阴活血法为指导的中药方剂能增强抑癌基因p16的表达,同时使原癌基因c-myc的表达减弱;抑癌基因p16的表达增强和原癌基因c-myc的表达减弱是健脾养阴活血法组方有效治疗胃癌前病变机制之一。
       【参考文献】
         　　［1］ 孙秀娣,牧 人,周有尚,等.中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测［J］.中华肿瘤杂志, 2004, 26(1)：4.
       
       ［2］ Testino G, Gornaggia M, De Iaco F. Intestinal metaplasia, highgrade epithelial dysplasia and gastric cancer［J］.Scand J Gastroenterol, 2002, 37(12):1475.
       
       ［3］ 张维铭,刘文天,徐 垚，等.应用荧光差异显示法对胃癌及癌前病变相关基因的研究［J］.癌症,2004,23(3):264.
       
       ［4］ DE Castro I P, Benet M, Jimenez M, et al.Mouse p10,an alternative spliced form of p15INK4b,inhibits cell cycle progression and malignant transformation［J］.Cancer Res, 2005, 65(8):3249.
       
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       ［6］ Hoffman B,Amanullah A,Shafarenko M,et al.The protooncogene c-myc in hematopoietic development and leukemcgenesis［J］.Oncogene,2002,21(21):3414.
       
       ［7］ Teruo Endoh,Naoki Tsuji,Koichi Asanuma,et al.Survivin enhances telomerase activity via up-regulation of specificity protein 1-and c-Myc-mediated human telomerase reverse transcriptase gene transcription［J］.Experimental Cell Research,2005,305(2):300.
       
       ［8］ Grandori,Carla,Gomez-Roman,et al.c-myc binds to human ribosomal DNA and stimulates transcription of rRNA genes by RNA polymerase I［J］.Nature Cell Biology,2005,7(3):311.