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       【摘要】 
       目的采用偏最小二乘法（PLS）建立测定八角茴香中莽草酸含量的近红外光谱定量分析模型。方法应用多种光谱预处理方法分别对八角茴香固体粉末样品的近红外光谱进行预处理，并采用预处理后的光谱分别建立定量分析模型，模型经过选择最适主因子数进行优化。结果经过比较各个模型的内部交互验证均方根误差（RMSECV）和交互验证预测值与实验测得值间的相关系数（Rv），外部均方根误差（RMSEP），选取最优的模型。结论结果表明定量分析模型稳健性好和预测精度高，在中药有效成分定量分析方面有很大的应用前景。
       【关键词】  八角茴香 近红外光谱 偏最小二乘法 莽草酸
       八角茴香为木兰科植物八角茴香Illicium verum Hook f.的干燥成熟果实，产于中国南方地区和越南，是我国重要“药食同源”经济树种，为我国特产辛香料和中药。八角茴香中普遍含有莽草酸，是莽草酸的丰富来源之一。研究表明莽草酸具有很好的抗炎、镇痛和抑制血小板聚集的作用，是有效对付致命的H5N1型禽流感病毒的药物“达菲”的合成中间体［1，2］，具有广阔的开发价值和应用前景。
       
       近红外光谱波长范围在780～2 500 nm，有机化合物在该区有吸收。其特点是吸收较弱，样品不需稀释就可测量，适于组分的常量分析，易于实现简便快速的非破坏分析。但谱带较宽，组分间谱带重叠严重，给直接分析带来困难［3，4］。化学计量学可有效地解决这个问题。偏最小二乘法(Partial Least Square， PLS)是目前化学计量学中最有效的分析方法之一。
       
       莽草酸的常规测量方法为高效液相色谱法（HPLC）［5］，该方法通常需要合适的溶剂，经过超声波等方法进行提取，前期预处理非常繁琐、费时，而且因需要大量的有机试剂而污染环境和对操作人员造成伤害。本文采用NIR光谱结合偏最小二乘法（PLS）建立测定八角茴香中莽草酸含量的定量分析模型。本实验所建立的测定八角茴香中莽草酸含量的定量分析模型具有较高的预测精度，为中药中有效成分含量的测定提供一种新方法。
       1  材料与仪器
          
       八角茴香购于沈阳家乐福超市；莽草酸对照品购于Sigma公司；甲醇和H3PO4，分析纯；乙腈，色谱纯。
       
       高速万能粉碎机，型号FW100，天津市泰斯特仪器有限公司；超声波细胞粉碎机，型号KS600，宁波科生仪器厂；高效液相色谱仪（WATERS）；紫外可见分光光度计，型号UV3150，日本岛津公司；积分球，型号ISR3100，日本岛津公司。
       2  方法
       2.1  光谱测量64个不同产地的八角茴香干燥果实样品于100℃烘箱中烘干2 h，粉碎，过0.45 mm筛，制成粉末样品。采用可见近红外分光光度计及附件积分球采集八角茴香粉末样品的近红外光谱，仪器参数设置为光谱范围1 750～2 000 nm，光谱通带宽度为12 nm，每个样品进行近红外扫描3次，取平均值作为该样品的近红外光谱。
        
       2.2   HPLC法测定莽草酸含量精密称取一定量的八角茴香粉末样品，加入一定量的甲醇，使液料比为46.4∶1（ml∶g），采用超声波细胞粉碎机，超声波功率设为318 W，超声提取202 s，提取液10 000 r/min离心10 min，上清液过45 μm微孔滤膜，滤液作为待测样品液。精密称取一定量的莽草酸对照品（Sigma公司），配制成浓度为0.700，0.450，0.300，0.150和0.075 mg/ml标准溶液，以乙腈2 %H3PO4（体积比95∶5）为流动相，采用Waters 600高效液相色谱系统、Waters 2487双波长检测器和Kromasil NH2 (4.6 mm×150 mm， 5 μm)色谱柱测定所配制的莽草酸标准溶液的峰面积，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl；检测波长：213 nm。以标准样品莽草酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，曲线回归方程为Y=1.447 78×107X+1.053 69×105，R=0.999，按上述条件测定64个待测样品液中莽草酸含量。
        
       2.3  PLS定量分析模型的建立根据样品NIR光谱的第一主分得分(PC1)为横坐标，第二主成分得分(PC2)为纵坐标所绘制的主成分得分图，将剩余的样品分成校正集和预测集，校正集样品用于建立校正模型，采用交互验证的方法检验模型的内部稳健性和拟合效果，其评价参数为交互验证均方根误差（RMSECV）和交互验证预测值与实验测得值间的相关系数（Rv），采用预测集检验模型的预测能力，防止模型过拟合，其评价参数为预测均方根误差（RMSEP），RMSECV和RMSEP的计算方法参考文献［6］。分别采用卷积平滑，快速傅立叶变换（FFT），一阶导数和二阶导数分别进行样品的NIR光谱预处理，原始光谱和各预处理后的光谱分别建立PLS定量分析模型，最后经过比较模型的内部稳健性、拟合效果和预测性能，选择最优的模型。
       3  结果与分析
       3.1  近红外漫反射光谱分析由图1可以看出近红外光谱谱峰重叠严重，用常规的线性分析方法无法分析。样品在1 750～1 875 nm近红外波区吸收相对较弱，在1 875～2 000 nm近红外波区吸收相对较强，出现较高的吸收峰。
       图1   八角茴香粉末样品近红外原始光谱图（略）
       3.2  校正集与预测集的选择样品的NIR光谱第一二主成分得分见图2。根据图 2将样品分成48个校正集样品和16个预测集样品，预测集样品较均匀地分布于校正集样品之中。
       图2   八角茴香粉末样品近红外光谱的第一、二主成分得分图（略）
       3.3  光谱预处理方法的选择 近红外光谱仪所采集的光谱除样品的自身信息外，还包含了其它无关信息和噪音，如电噪音、样品背景和杂散光等。针对特定的样品体系，通过对光谱的适当处理或变换，减弱以至于消除各种非目标因素对光谱的影响，尽可能地去除无关信息变量，提高分辨率和灵敏度，从而提高校正模型的预测能力和稳健性。
       
       分别采用FFT、卷积平滑、一阶导数和二阶导数对八角茴香粉末样品的NIR光谱进行预处理，采用FFT和卷积平滑光谱预处理方法时，考察了不同移动窗口大小对预处理效果的影响；采用一阶导数和二阶导数光谱处理方法时，考察了不同差分宽度对预处理效果的影响。分别采用预处理后的光谱，在各个划分区域下建立定量分析模型，每个模型经过内部交互验证和外部预测集的验证，结果见表1。由表 1可以看出，原始光谱所建立的PLS定量分析模型，其RMSECV值为0.067 4，为所建立模型的最低值，但其Rv仅为0.348 2，说明模型拟合效果很不好，故不采用。采用窗口大小为20的二阶导数预处理后的光谱所建立的PLS定量分析模型的RMSECV为0.123 1，相对较低，Rv为0.916 7，相对较高，而RMSEP为0.191 2也比较低，模型的内部稳健性、拟合度和预测能力均比较好，选定二阶导数做为光谱的预处理方法，其窗口大小选择20。
       表1   不同预处理方法处理后的光谱在不同光谱区域所建立的定量分析模型的内部交互验证和外部验证结果（略）
       3.4  主因子数的选择使用PLS方法建立定量校正模型时，主因子数（又称主成分数）的选择直接关系到模型的实际预测能力。若建立模型时使用的主因子数过少，就不能充分反映样品被测组分产生的光谱信息，从而导致不充分拟合，其模型预测准确度就会降低；若使用主因子数过多则会将一些包含了噪音的信息也掺入计算，就会导致过拟合，从而降低模型的预测能力。本文采用留一交互验证法，考察主因子数对PRESS与RMSECV的影响，当PRESS与RMSECV均最小的时候，所选的主因子数最适。应用八角茴香二阶导数近红外光谱，选择波长范围为1 750～2 000 nm建立八角茴香莽草酸含量定量分析模型，对该模型进行交互验证，得出主因子数对PRESS与RMSECV的影响（见图3）。由图3可以看出莽草酸定量分析的最适主因子数为3。
       图3   主因子数与PRESS、RMSECV相关图（略）
       3.5  最佳模型的建立经过选择校正集与预测集、选择光谱预处理方法等方法的研究，得出采用波长范围为1 750～2 000的二阶导数（窗口大小20点）近红外光谱，莽草酸含量的最适主因子数为3，建立八角茴香中莽草酸含量的最佳的定量分析模型。该模型对预测集与校正集的预测值与实验测得值的相关图(见图4)。最佳定量分析模型对样品各组分的预测值与实验测得值相吻合得很好，其RMSECV、Rv和RMSEP值分别为0.123 1，0.916 7和0.191 2。
       图4  八角茴香预测集与校正集的预测值与实验测得值的相关图（略）
       4  结论
       
       　　本文应用PLS方法结合NIR光谱建立了测定八角茴香中莽草酸含量的定量分析模型，模型经过校正集样品的内部的交互验证和预测集对模型预测能力的检验，选择有效的光谱预处理方法和最适的主因子数，得到最优的PLS定量分析模型。结果表明该方法可行，且方便快捷，不用前处理，还可在线检测，无破坏性，有很大的应用前景。
       【参考文献】
         　　［1］ 林 祁. 八角属药用植物资源［J］.中草药， 2002， 33(7): 654.
       
       ［2］ 马 怡， 孙建宁， 徐秋萍， 等. 莽草酸对血小板凝集和凝血的抑制作用 ［J］. 药学学报， 2000， 35(1): 1.
       
       ［3］ Mcclure W F. 204 years of near infrared infrared technology: 18002003 ［J］.J. Near Infrared Spectrosc.， 2003， 11: 487.
       
       ［4］ 陆婉珍， 袁洪福， 徐广通. 现代近红外光谱分析技术 ［M］. 北京: 中国石化出版社， 2000：10.
       
       ［5］ 王晓强， 郭亚健， 杨春树. 高效液相法测定八角属部分植物果实中莽草酸的含量 ［J］.中国中药杂志， 2001， 26(7): 447.
       
       ［6］ Mcclure W F. 204 years of near infrared infrared technology: 18002003［J］.J. Near Infrared Spectrosc.， 2003， 11: 487.