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       【摘要】 
       目的研究老鼠簕对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGFβ1）与Smad3 mRNA表达的影响。方法Wistar大鼠随机分成5组：空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组、老鼠簕乙醇浸膏低剂量组和老鼠簕乙醇浸膏高剂量组。除空白对照组外，其余4组用CCl4制备大鼠肝纤维化模型。秋水仙碱组、老鼠簕乙醇浸膏低剂量组和老鼠簕乙醇浸膏高剂量组分别于4周后给予相应的药物，空白对照组给予等容量的生理盐水，1次/d。8周后处死大鼠，RT-PCR检测肝组织中TNF-α，TGFβ1 与Smad3 mRNA的表达。结果与空白对照组相比，模型对照组TNF-α，TGFβ1 与Smad3 mRNA表达增强（0.23±0.18vs0.49±0.28，0.29±0.16vs1.79±2.13, 0.52±0.36vs0.99±0.53，P<0.01）；老鼠簕乙醇浸膏高、低剂量组（2.0，1.0 g·kg-1）较模型对照组TNF-α，TGFβ1 与Smad3 mRNA表达减弱（1.0 g·kg-1：0.29±0.21vs0.49±0.28，0.62±0.44vs1.79±2.13, 0.59±0.34vs0.99±0.53，P<0.05；2.0 g·kg-1：0.16±0.13vs0.49±0.28，0.66±0.51vs1.79±2.13, 0.53±0.41vs0.99±0.53，P<0.05）。结论老鼠簕能够抑制大鼠肝纤维化肝组织TNF-α，TGFβ1 与Smad3mRNA的表达。
       【关键词】  肝纤维化 老鼠簕 肿瘤坏死因子α 转化生长因子β1 Smad3
       老鼠簕Acanthus ilicifolius Linnseus是一种生长在热带海岸地带的红树林植物，属爵床科（Acanthaceae）老鼠簕属Acanthus。老鼠簕收录于《全国中草药汇编》，全株或根入药，具有清热解毒、消肿散结、止咳平喘之功效，主治淋巴结肿大、急慢性肝炎、肝脾肿大、胃痛、咳嗽、哮喘［1］。
       
       肝纤维化的形成机制是细胞外基质（ECM）的合成和降解失调。肿瘤坏死因子α（TNF-α）在肝纤维化始动激活及调控中具有重要作用；转化生长因子β1（TGFβ1）是导致肝纤维化的最重要的细胞因子, 其作用的发挥和细胞内信号转导蛋白Smad 密切相关。其中，Smad3是介导TGFβ1诱导肝纤维化的关键分子。本实验观察老鼠簕治疗大鼠实验性肝纤维化的疗效，研究大鼠肝组织TNF-α、TGFβ1 与Smad3 mRNA的表达情况，探讨老鼠簕对大鼠肝纤维化的治疗机制。
       1  材料
       1.1  动物清洁级Wistar大鼠60只，体重（180±20） g，由广西医科大学实验动物中心提供。
       1.2  药品及配制老鼠簕乙醇浸膏由本课题实验组提取。取100 g老鼠簕乙醇浸膏，用单蒸水配制成高剂量浓度为0.2 g（相当于生药材46.60 g）·ml-1的药液；取50 g老鼠簕乙醇浸膏，用单蒸水配制成低剂量浓度为0.1 g·ml-1的药液。 -4℃保存备用，使用前摇匀；秋水仙碱（西双版纳股份药业有限责任公司，批号：060717），用单蒸水配制成浓度为0.040 mg·ml-1的药液。
       1.3  试剂四氯化碳（上海化学试剂公司，批号20050393）。Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen）；RT-PCR逆转录试剂盒（美国Fermentas）；无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂，批号20070126）；三氯甲烷（重庆川江化学试剂厂，批号20070507），异丙醇（成都市科龙化工试剂厂，批号20070418）。
       2  方法
       2.1  建立大鼠肝纤维化模型［2］及给药方法60只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组、老鼠簕乙醇浸膏高剂量组和老鼠簕乙醇浸膏低剂量组。每组12只。除了空白对照组外，其余各组大鼠第1次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.05 ml·kg-1，以后每周2次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.03 ml·kg-1。空白对照组仅皮下注射等体积植物油。连续8周。在注射四氯化碳4周后，秋水仙碱组以0.4 mg·kg-1、老鼠簕乙醇浸膏高、低剂量组分别以2.0，1.0 g·kg-1，用等容量给药法按10 ml·kg-1灌胃，1次/d。空白对照组和模型对照组给予等容量的生理盐水。连续4周。
       2.2  标本采集所有大鼠于第8周末处死，取肝左叶组织1块，于-70℃保存。
       2.3  肝组织TNF-α、TGFβ1 与Smad3 mRNA的表达测定Trizol提取大鼠肝组织总RNA，方法按试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA纯度，按RT-PCR逆转录试剂盒说明把mRNA逆转录成cDNA。RT-PCR分析TNF-α、TGFβ1 与Smad3，β-actin作为内参。TNF-α、TGFβ1 、Smad3和β-actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。TNF-α上游引物序列：5’TGCCTCAGCCTCTTCTCATT 3’，下游引物序列： 5’TGGTATGAAGTGGCAAATCG 3’，扩增产物长度为404bp；TGFβ1上游引物序列：5’TACAGGGCTTTCGCTTCAGT 3’，下游引物序列： 5’TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3’，扩增产物长度为394bp；Smad3上游引物序列：5’GCAGTGGCAATCACAGAGAA 3’，下游引物序列： 5’AACAGCCTGGGAGAGACTCA 3’，扩增产物长度为386bp；β-actin上游引物序列：5’AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG 3’，下游引物序列： 5’TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT 3’，扩增产物长度为240bp。取5μg总RNA按逆转录试剂盒说明书逆转成cDNA。以cDNA为模板分别按以下条件PCR反应扩增TNFα、TGFβ1 和Smad3片断。TNF-α PCR条件：94℃ 4min 30s，94℃30s，52℃30s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 8 min；TGFβ1 PCR条件：94℃ 4 min 30 s，94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 8 min；Smad3 PCR条件：94℃ 4 min30 s，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 8 min。取5 μl PCR产物，在2%琼脂糖凝胶（含溴乙啶）上电泳，电泳条件：120V，20min，凝胶电泳成像分析系统采集图像。以内参β-actin为基准作半定量分析，以扩增目的基因区带的灰度值与内参β-actin区带的灰度值之比确定各扩增目的基因的相对表达水平。
       2.4  统计学方法用SPSS13.0软件分析，计量资料用±s表示，多样本均数采用方差分析。P＜0.05表示差异有显著性意义。
       3  结果
       3.1  肝组织总RNA的提取提取的总RNA通过测定OD260/OD280比值均介于1.7～2.0之间，表明各样品RNA纯度符合实验要求。经1%琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察，未见RNA明显降解。 
       3.2  肝组织TNF-α、TGFβ1 与Smad3 mRNA的表达大鼠肝组织TNF-α mRNA、TGFβ1mRNA、Smad3 mRNA均表达，见图1～3。从表1可知，大鼠模型对照组与空白对照组的TNF-α，TGFβ1 、Smad3 mRNA表达水平差异有显著性（P＜0.01），表明TNF-α，TGFβ1 、Smad3在肝纤维化大鼠肝脏大量表达；秋水仙碱组、老鼠簕乙醇浸膏高剂量组、老鼠簕乙醇浸膏低剂量组分别与模型对照组相比，差异有显著性（P＜0.05），表明TNF-α，TGFβ1 ，Smad3在各组中的表达均较模型对照组有所降低。
       图1  肝组织TNF-α mRNA的表达（略） 
       图2  肝组织TGFβ1mRNA的表达（略）
       图3  肝组织Smad3 mRNA的表达（略）
       表1  老鼠簕对肝纤维化大鼠肝脏TNFα mRNA，TGFβ1 mRNA和Smad3 mRNA表达的影响（略）
       与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01；n=12
       4  讨论
          
       肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，其主要机制是细胞外基质合成与降解失调。肝星状细胞（HSC）是肝纤维化发生发展的关键细胞，有多种细胞因子对HSC具有激活、增生及转化的作用。
       
       在肝纤维化过程中TNF-α对HSC的增殖、活化以及ECM的合成、基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的释放起重要作用。TNFα能上调活化的HSC中蛋白水解酶抑制物的合成，从而抑制基质的降解［3］。作为炎性细胞因子，TNF-α刺激枯否细胞释放更多的细胞因子如TGFβ1等，形成正反馈的放大作用，产生更多的ECM［4］。TNF-α主要是通过刺激肝脏炎症反应的产生而发挥其促纤维化作用［5］。TNF-α与肝纤维化有关的作用包括：① 诱发急性炎症过程；②加强HSC的趋化性；③ 刺激间质细胞有丝分裂；④ 诱发蛋白多糖的合成。
       
       研究表明ECM的合成与降解很大程度上由TGFβ1控制，TGFβ1突出作用是促进胶原与细胞外基质的形成，同时抑制其胶原酶的降解。在TGFβ1作用下，HSC被激活或转化为肌成纤维细胞［6］。激活的HSC自身也合成、分泌TGFβ1，HSC在自分泌和旁分泌的TGFβ1作用下大量活化，这种自分泌正反馈调节是肝纤维化得以发展的重要环节［7］。TGFβ1 对HSC 的活化信号必须经过细胞膜相应受体及其下游效应分子如Smad 蛋白,启动HSC细胞内信号传导系统。Smad蛋白是目前发现的TGFβ家族受体激酶的关键作用底物［8］,是将配体与受体作用的信号由胞浆传导到胞核的中介分子。Schnabl 等［9］报道，在肝纤维化发生发展的分子机制中,有Smad蛋白的参与, 以Smad3 为代表的R-Smad分子传递的可能是致肝纤维化信号。Smad3是介导TGF-β1诱导肝纤维化的关键分子。TGF-β1激活的肝星状细胞主要表达Smad3［10］。本研究显示在肝纤维化模型组，Smad3表达升高，随着用药组的治疗，Smad3表达减弱，表明Smad3参与调节胶原的转录。
       
       本实验研究结果显示，老鼠簕乙醇浸膏能抑制TNF-α，TGFβ1 与Smad3 mRNA转录，抑制HSC活化，促进细胞外基质的降解，减弱肝纤维化的程度。提示老鼠簕乙醇浸膏可通过发挥对细胞因子TNFα，TGFβ1 与Smad3的影响，减少由于CCl4染毒而导致肝内胶原产生和沉积，在多个环节抑制肝纤维化的形成，从而为老鼠簕防治肝纤维化提供了一定的实验依据。
       【参考文献】
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