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       【摘要】 
       目的建立复方银杏叶片中银杏总黄酮含量的测定方法。方法在中性介质中，银杏黄酮与Cu2+缔合为棕黄色沉淀，经流动注射在线过滤稀释，以AAS法测定反应剩余Cu2+的量来间接测定银杏黄酮的含量。结果银杏黄酮浓度在4.0～30 μg/ml范围内与反应中剩余Cu2+的量呈良好的线性关系，方法的标准差1.1%，回收率101%～105%。结论该法操作简便, 易于实现自动化，结果准确，专属性强，可作为银杏叶片的质量控制方法。
       【关键词】  银杏黄酮 原子吸收 在线过滤 流动注射
       银杏Ginkgo biloba叶的主要活性物质是银杏黄酮类（flavonoids）和银杏内酯化合物，研究表明，银杏黄酮类物质能促进心脑血管系统的代谢，作为植物药物能有效促进神经末梢和大脑的血液流通，对治疗心脑血管病和老年痴呆等多种顽疾具有明显的效果［1］，目前其测定方法主要有高效液相色谱法［2，3］、紫外分光光度法［4，5］ 、荧光分光光度法［6］。
       
       本文是在中性介质条件下，利用银杏黄酮结构中的临酚羟基与醋酸铜络合，产生棕黄色沉淀，用流动注射在线过滤-原子吸收光谱法（FI-AAS）测定上层清液中剩余Cu2+ 的量，从而间接测定了银杏黄酮的含量。本法操作简便、快捷、灵敏度高、节省试剂、易于实现自动化，同时克服了一般AAS法中沉淀手工分离、洗涤、稀释的繁琐，用于银杏黄酮的测定，获得满意结果。
       1  器材与方法
       1.1  仪器与试剂TAS-968原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；IFIS-B型智能流动注射进样器（西安瑞科数字记录有限公司）； 420Aplus型酸度计（美国ORION公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。
       
       银杏黄酮标准储备液：准确称取0.100 0 g银杏黄酮标准品（﹥99.2%，鼎国生物责任有限公司提供），用50%乙醇溶解并定容于100 ml容量瓶中，配制成1.0 mg/ml的标准储备液，用时稀释成0.2 mg/ml的标准使用液；醋酸铜溶液（1.0 mg/ml），用时稀释成0.1 mg/ml的标准使用液。
       
       以上试剂均为分析纯，水为二次去离子水。
       1.2  仪器最佳条件波长324.7 nm；通带宽0.4 nm；灯电流3.0A；燃烧器高度5 mm；乙炔流量1.5 L/min，空气流量8.5 L/min。
       1.3  方法原理银杏黄酮的基本结构通式为：
       由于银杏黄酮分子结构中存在临酚羟基，故黄酮分子在中性介质条件下能与铜离子络合生成难溶的棕黄色沉淀，经过流动注射在线过滤分离后，通过原子吸收法测定滤液中剩余的Cu2+，从而间接测定银杏黄酮的含量。
       1.4   实验方法移取一定量的银杏黄酮标准使用液于10 ml比色管中，加0.1 mg/ml的醋酸铜溶液，用水稀释至刻度，充分混匀，在80℃ 水浴中反应20 min后，将溶液引入FI-AAS流路（见图1）进行测定。
       R试剂  S样品  P蠕动泵  F过滤器  RC反应盘管  D原子吸收分光光度计  W废液
       图1  FIAAS流路图（略）
       2   结果与讨论
       2.1  化学参数的影响
       2.1.1  反应温度的影响移取一定量的银杏标准使用液，按实验方法在20～100℃范围内进行实验。见图2。结果表明，随着温度的升高，沉淀增多，吸光度值逐渐减小；当温度在80～90℃时吸光度值较稳定，说明此时沉淀反应完全。因此，实验在80℃水浴中进行。
       图2  反应温度对吸光度的影响（略）
       2.1.2   酸度的影响溶液酸度的大小对沉淀的生成有一定影响。取一定量银杏黄酮标准使用液，在不同的pH条件下，按实验方法进行实验，见图3。由图3可看出，pH值在6.0～8.0范围内吸光度值小而稳定。当pH＜6时，沉淀量少，溶液中剩余Cu2+浓度偏高，吸光度值较大；当pH﹥8时，生成的沉淀物可能部分溶解，吸光度值较大。本文反应选择在中性介质中进行。
       图3  pH值对反应的影响（略）
       2.1.3   反应时间的影响取一定量的银杏黄酮标准使用液，按实验方法操作，在80℃水浴中反应不同的时间，测定其吸光度，见图4。结果表明，反应25 min以后，吸光度值趋于稳定。实验选用反应时间为25 min。
       图4  反应时间对吸光度的影响（略）
       2.1.4  试剂用量的影响醋酸铜溶液的用量对测定结果有一定影响。实验选用不同量的醋酸铜试剂进行实验。结果表明：沉淀剂用量太少，沉淀不易生成；用量太多，造成标准曲线弯曲。当Cu2+用量大于1.0 ml时，溶液的吸光度值稳定且灵敏，反应完全，但不容易达到在线稀释的目的。故本文选择Cu2+ 用量为1.0 ml。
       2.2  流动注射参数的选择
       2.2.1  采样环体积、混合管长度及载流流速的影响在最佳化学反应条件下，研究了采样环体积、混合管长度及载流流速对测定结果的影响。结果表明，随着采样环体积增大，吸光度也增大，但为了达到在线稀释的目的，需要采用小体积的采样环；混合管道越长，稀释效果越明显，但当管长超过1 m后，吸光度增加缓慢，而且过长的管道也降低了采样频率；当采样体积、混合管道一定时，随流速的增加，吸光度值逐渐增大，但当流速大于4.5 ml/min后，吸光度增加缓慢。这是由于载流越快，对流作用的增强与扩散作用的减弱相抵消，分散度不再变化［7］，综合考虑，本文选择流动注射参数的最佳值见表1。
       2.2.2  过滤器的选择本文选用了内填微孔滤膜为0.22 μm的柱形过滤器，过滤效果比较理想，重现性也好。过滤器外径16 mm，内径12 mm，进出口孔径1 mm，内填树脂做的微孔滤膜一张。
       表1  流动注射参数的优化（略）
       2.3  重复性实验分别移取1 ml银杏黄酮的标准使用液10份，按实验方法测定，相对标准偏差为1.1%。
       
       2.4   标准曲线的绘制     分别移取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6 ml的银杏黄酮使用液于10 ml比色管中，按实验方法测定，以吸光度A对浓度C绘制工作曲线，如图5。其线性回归方程：A=-0.016 2C+0.619 8，r = 0.999 6。
       图5  银杏黄酮的标准工作曲线（略）
       2.5   共存物的影响经银杏黄酮内含物纯品验证：在银杏黄酮标准液中分别加入同倍于银杏黄酮的淀粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉溶液，糊精、乳糖、维生素C，对测定结果无影响；而同倍的氨基酸、Pb2+对测定有干扰，但在一般情况下，银杏黄酮中氨基酸、Pb2+ 含量较少。为了减少氨基酸对测定的影响，建议选用银杏黄酮在4.0～30 μg的低浓度进行测定。
       3  样品的测定
       3.1   样品的前处理准确称取银杏黄酮药品15粒，研磨混匀，称取适量（相当于银杏黄酮100 mg）溶解，定容于100 ml容量瓶中，于过滤后取其滤液10 ml定容于100 ml容量瓶中，待测定。
       3.2   样品测定取银杏黄酮样品溶液1 ml，按实验方法测定，计算样品含量，同时做回收率实验。结果见表2。
       表2  样品的测定结果及方法回收率（略）
       【参考文献】
         　　［1］ 黄天芳.银杏资源开发现状［J］.生物学杂志，1997，14（2）:26.
       
       ［2］ 袁 龙.高效液相色谱法测定银杏叶片剂中银杏黄酮含量［J］.西北药学杂志,2004,19(6):246.
       
       ［3］ 董文庚，邓晓丽，苗凤智. HPLC法测定银杏叶中黄酮的含量［J］.理化检验·化学分册 , 2005,41(8)：63.
       
       ［4］ 曾凡骏，陈松波，曾 里，等.一种改进的银杏黄酮紫外分光光度检测方法的研究［J］.食品科学 , 2003,24(11) :102.
       
       ［5］ 上官小东，郎惠云，赵 莉.钨酸钠-分光光度法测定银杏黄酮含量［J］.西部粮油科技，2003，28（2）:61.
       
       ［6］ 张 敏，邱朝晖，曹 庸，等. 荧光光度法测定银杏叶总黄酮含量的研究［J］. 时珍国医国药,2005，16（3）:238.
       
       ［7］ Fang Z L.Flow Injection Atomic Absorption Spectrometry［M］. New York:Wily,1995:77.