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       【摘要】 
       目的研究绿茶提取物和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对脾脏细胞增殖和巨噬细胞NO分泌的影响。方法采用MTT法检测脾脏细胞增殖变化，用Griess试剂法检测NO产量的变化。结果绿茶提取物和EGCG都能够促进脾脏细胞增殖，并能够协同conA刺激脾脏细胞的增殖；还能够抑制LPS激活的巨噬细胞RAW264.7的NO产量。结论绿茶提取物和EGCG具有免疫调节和减轻炎症反应的有益作用。
       【关键词】  绿茶 表没食子儿茶素没食子酸酯 免疫细胞
       Study on the Effects of Green Tea Extract and EGCG on Immune Cells
       ZHANG Feng, YANG Guiwen, ZHANG Fumiao, ZHAO Jing, CUI Yingjie, AN Liguo*
       (Taishan Medical College,Taian 271000, China; Laboratory of Annimal Resistance,College of Life Sciences,Shandong Normal University,Jinan 250014, China; Taishan Medical College, Taian 271000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of green tea extract and Epigallocatechin gallate（EGCG） on spleen cell proliferation and macrophage NO production.MethodsMTT assay was used to detect spleen cell proliferation change and Griess reagent method was used to detect macrophage NO secretion. ResultsGreen tea extract and EGCG could promote spleen cell proliferation and be able to cooperate with conA to stimulate spleen cell proliferation.They could also inhibit LPS-activated macrophages RAW264.7 NO production.ConclusionGreen tea extract and EGCG have immunoregulative effect and can alleviate inflammatory reaction.
       Key words：Green tea;  EGCG;  Immune cells
       
       现代研究表明绿茶具有抗氧化、抗癌和防癌、降血糖、抑菌和抗病毒等生物学活性［1～5］。在人们日益注重保健养生的今天，绿茶的系列生物学活性无疑也成为研究的热点。本实验选用山东日照绿茶为材料，用70％乙醇法抽提得到绿茶提取物，研究其对免疫细胞的作用。
       1  器材
          
       昆明种小鼠（山东大学实验动物中心）。EGCG （Sigma）；绿茶提取物（70％乙醇法抽提）；RPMI 1640干粉（GIBCO）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；噻唑蓝（Sigma）； 青霉素、链霉素（北京鼎国生物技术发展中心）；ConA（Sigma）；LPS（Sigma）；DMR 显微镜（Leica）；MCO-17AC二氧化碳培养箱（SANYO；Model 550 酶标仪（BIO-RAD）。
       
       红细胞裂解液：NH4 Cl  8.29 g，KHCO3 1 g，EDTANa 37.2 mg。将以上试剂溶解于800 ml三蒸水，充分搅拌溶解混匀后，用1N的盐酸调pH值至7.2～7.4，加水补足到1 000 ml。过滤除菌，4℃保存备用。
       
       Griess试剂：A液：对氨基苯磺酰胺0.5 g，10％醋酸150 ml；B液：α－萘胺0.1 g，三蒸水20 ml，10％醋酸150 ml，冰箱中保存，使用前A液B液等体积混合。
       2  方法
       2.1  MTT法测定小鼠脾脏细胞的增殖取实验小鼠，脱颈处死。无菌条件下取出脾脏，剪碎，200目尼龙网过滤。收集的细胞以无血清RPMI1640培养液洗涤两遍，收集后加红细胞裂解液，中止裂解后收集细胞，以无血清RPMI1640培养液洗涤两遍，重悬细胞于RPMI1640培养液中。调整脾脏细胞浓度为（2×106 cells / ml），置于96孔板中，绿茶提取物或EGCG作用48 h及绿茶提取物或EGCG与ConA（20 μg/ml）共作用48 h。实验终止前4 h每孔加MTT (5 mg/ml) 20 μl，离心，弃上清液中止反应，每孔加150 μl 二甲基亚砜，轻轻摇动30 min溶解紫色结晶，490 nm波长酶标仪比色。
       
       SI=ConA刺激后A值/未加刺激A值
       2.2  Griess’ S法测定巨噬细胞RAW264.7 NO产量NO的定量可通过测定NO2-和NO3-的总和来实现，根据这一原理，应用Griess’ S 试剂来定量检测NO水平。巨噬细胞培养上清与Griess’S 试剂室温下反应10 min，于490 nm处检测吸光值。
       3  结果
       3.1  MTT法测定小鼠脾脏细胞的增殖
       3.1.1  绿茶提取物对小鼠脾脏细胞增殖的影响MTT法检测绿茶提取物对小鼠脾脏细胞增殖的影响，结果表明它不仅能刺激脾脏细胞增殖，而且也能协同ConA刺激脾脏细胞的增殖。见图1～2。
       3.1.2  EGCG对小鼠脾脏细胞增殖的影响MTT法检测EGCG对小鼠脾脏细胞增殖情况表明：EGCG体外也能够刺激脾脏细胞的增殖，并协同ConA刺激脾脏细胞增殖。见图3～4。
       
       3.2  Griess’ S法测定巨噬细胞RAW264.7 NO产量绿茶提取物和EGCG都能够降低LPS激活巨噬细胞RAW264.7 NO产量，浓度越高，作用越强（见图5～6）。
       图1  绿茶提取物体外刺激脾脏细胞增殖（略）                  
       图2  绿茶提取物对ConA刺激的脾脏细胞增殖的影响（略）
          
       图3  EGCG体外对脾脏细胞增殖的影响（略）            
       图4  EGCG对ConA刺激的脾脏细胞增殖的影响（略）
       
       图5  绿茶提取物对LPS激活巨噬细胞RAW264.7NO产量的影响（略）           
       图6  EGCG对LPS激活巨噬细胞RAW264.7 NO产量的影响（略）
       4  讨论
          
       脾脏内的大量免疫细胞是其执行免疫功能的基础,其中包括巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞( dendritic cell, DC) 等。脾脏既可通过吞噬作用完成机体的非特异性免疫功能,也可以通过T 细胞介导的细胞免疫和B 细胞介导的体液免疫完成机体的特异性免疫功能,脾脏同时也是产生记忆性T细胞、B 细胞的重要场所,对再次免疫应答起重要作用［6］。T淋巴细胞在非特异性物质刺激下，可被激活向淋巴母细胞转化，在转化过程中DNA、RNA及蛋白质合成增加，使细胞分裂增殖。淋巴细胞的分裂增殖则是其发挥作用大小的一个衡量指标。已知ConA激活T细胞增殖时可释放IL-2与IFN-γ等多种淋巴因子，且IFN-γ有促肾上腺皮质激素和β-内啡肽的活性片断，均具有免疫调节作用。实验表明绿茶提取物和EGCG都能够刺激脾脏细胞增殖，并且能够协同conA促进T淋巴细胞的增殖。因此，它们都能促进免疫活性物质的释放，具有免疫调节作用。同时，T 细胞引起的特异性免疫应答在机体清除病原体、移植免疫和抗肿瘤免疫中有重要作用。T 细胞还能够分泌淋巴因子在多个环节上参与免疫调节［7，8］。综上，绿茶提取物及EGCG能够通过促进免疫细胞增殖和免疫活性物质的释放来发挥其免疫调节作用。
       
       巨噬细胞具有较强的吞噬能力和杀伤能力，是近年来研究比较活跃的一种重要的免疫活性细胞。它们既参与非特异性免疫这一重要的生理过程，又能够呈递抗原，产生细胞因子参与特异性免疫应答。NO是巨噬细胞等对病原体和肿瘤细胞的细胞毒活性的效应分子，主要由活化的巨噬细胞等大量的表达一氧化氮合酶时产生。一氧化氮合酶在正常生理情况下不表达，主要在巨噬细胞、中性粒细胞和免疫细胞等受到细胞因子（如IFN-γ，TNF-α，Il-2，Il-1等）及细菌脂多糖（LPS）作用时被激活而产生，先表达iNOS的mRNA，再生成iNOS，从而诱导产生持续时间长且大量的NO［9，10］。高水平的NO对细胞主要发挥细胞毒作用，NO本身有毒性，能抑制线粒体酶，如柠檬酸合成酶、乌头酸酶等，此外NO能与超氧阴离子（O-2·）反应产生一种氧化性更强的自由基——过氧亚硝酸盐（ONOO-），这种自由基很稳定，一旦进入靶细胞或邻近细胞将引起强烈的细胞毒性作用甚至损伤组织，因此，测定巨噬细胞产生NO的变化情况，对判断机体免疫状态具有重要的意义。
       
       利用内毒素LPS作为巨噬细胞（RAW 264.7）的NO合成诱导剂，加入不同浓度绿茶提取物或EGCG，培养后取上清液，测定NO产生量。发现绿茶提取物和EGCG对LPS诱导的NO合成均有明显的抑制作用，其抑制作用具有显著的量效关系。因此，绿茶提取物和EGCG一定意义上都能够抑制炎症介质的生成，从而减轻炎症反应。然而，这种作用是如何发挥的，是通过抑制一氧化氮合酶的产量和活性还是通过其他途径，还需要进一步实验证实。
       
       综上所述，绿茶提取物体外具有免疫调节和减轻炎症反应等有益作用，这就为开发绿茶提供了实验基础。
       【参考文献】
         　　［1］ Schut HA, Yao R. Tea as a potential chemopreventive agent in PhIP carcinogenesis: effects of green tea and black tea on PhIP-DNA adduct formation in female F-344 rats［J］. Nutr Cancer，2000,36(1):52.
       
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