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       【摘要】 
       目的 探讨宁心红杞含药血清对离体大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制。方法体外培养的卵巢颗粒细胞中用氯化镉造模，加入宁心红杞含药血清共同作用24 h后收集颗粒细胞，通过流式细胞仪观察其凋亡现象和用酶标法检测caspases-3蛋白的表达。结果流式细胞仪结果显示宁心红杞含药血清可明显改善氯化镉导致的颗粒细胞凋亡，凋亡峰较模型组明显降低；含药血清组明显降低caspases-3的表达，与模型组相比有显著性差异（P＜0.01）。结论宁心红杞可通过降低caspases-3蛋白的表达来改善颗粒细胞的凋亡，延缓卵巢衰老。
       【关键词】  宁心红杞含药血清 卵巢 颗粒细胞 凋亡
       Effects and Mechanism of Serum with Menoprogen on Ovary Granulosa Cell Apoptosis
       LI Yu, QI Xu,WANG Mingyan*，MA Hong
       （Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China; The First Affliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect and mechanism of menoprogen,on ovary granulose cells"(GC) apoptosis from female rats in vitro.MethodsCadmium chloride was added to induce model, then the serum with menoprogen from rats was added to culture GC for 24h, the apoptosis of cell sediment was observed through flow cytometry (FCM)and the expression of caspases-3 coas dectected by enzyme linked immunosorbent assay. ResultsThe result of flow cytometry showed the serum with menoprogen could obviously improve ovary granulose cell apoptosis induced by cadmium chloride, reduce the apoptotic peak as compared to model group, and decrease the expression of caspases-3,there was a significant difference between control group and model group(P＜0.01）. ConclusionThe menoprogen can improve ovary granulose cell apoptosis through decrease the expression of caspases-3, delay ovaries aging.
       Key words：Serum with menoprogen;  Ovary;  Granulose cells(GC);  Apoptosis
       
       细胞凋亡与卵巢正常或异常的功能相关，包括卵母细胞的损耗。很多研究证实生殖细胞的丢失源于细胞凋亡，但女性生殖细胞在发育过程中大量丢失的确切原因还不明了［1］。现代研究表明卵母细胞的凋亡仅是卵泡闭锁的开始，卵泡颗粒细胞的凋亡才是卵泡退化的根本原因［2］。宁心红杞胶囊主要由枸杞子、桑椹、红花、地黄等组成，在临床上用于治疗围绝经期综合征已取得确切疗效［3,4］。为了观察宁心红杞胶囊对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，我们以体外培养的SD大鼠排卵前卵泡颗粒细胞为实验对象，观察宁心红杞含药血清对其凋亡及caspases-3的影响。
       1  材料
       1.1  动物22～27日龄左右和3月龄健康雌性SD大鼠，由南京中医药大学动物实验中心提供。二级动物饲养条件［层流柜饲养，温度（24±2）℃，湿度60％左右，24 h通风，自然照明］饲养，普通饲料喂养，自由饮水。
       1.2  试剂孕马血清促性腺激素（PMSG）（南京创瑞生物试剂公司）；DMEM-F12培养基（1∶1）∶（GIBCO）；青链霉素溶液（江苏省人民医院）；小牛血清（杭州四季青试剂公司）；多孔细胞培养板（COSTAR）。
       1.3  药物宁心红杞胶囊干浸膏：由美福天然药物科技公司提供，每克干浸膏相当于原生药材165 g。生产批号：20040820。以许文生氏公式计算人的体表面积,再以Meeh-Rubner 氏公式计算1 kg 大鼠体表面积,采用直接计算法获得大鼠的每日宁心红杞胶囊用药量为0.324 g。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备及灭活取3月龄雌性SD大鼠,按体重随机分为正常对照组、宁心红杞胶囊组。宁心红杞胶囊组大鼠按日服量的5倍灌服宁心红杞水溶液，2次/d，连续给药3 d，第4天1次灌服全天剂量；正常对照组大鼠灌服等量生理盐水，同时取血。各组均于末次给药后1 h在麻醉状态下经颈动脉采血，将各组血液置于4℃放置4h，分离血清(1 000 r/min,10 min),取上清液，同组混匀。将每组血清混匀以0.22 μm滤器抽滤除菌，经56℃，30 min灭活后分装，-20℃保存备用。
       2.2  颗粒细胞的制备取22～27日龄雌性大鼠，皮下注射孕马血清（PMSG）50 IU/只，常规饲养48 h后颈椎脱臼法处死，用75％乙醇快速浸泡鼠身，剪开皮肤无菌摘取大鼠的双侧卵巢，置于事先准备好的装有生理盐水的西林瓶内，移至超净台内的玻璃皿中，去包膜及周边的脂肪组织，用NS清洗两次，置于玻璃皿中，以适量含100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM-F12的培养液中，用针头刺破卵泡膜，使颗粒细胞释放入培养液中，并轻轻吹打，使其分散成单个细胞，然后用400目尼龙膜过滤。将含GC的培养液收集在离心管中离心（1 000 r/min）5 min后收集细胞，用培养液洗两次后加入一定量DMEM-F12培养液重新悬浮细胞，用0.4％的台盼蓝染色，血细胞计数板计数活细胞数，细胞存活数大于90％，用DMEM-F12培养液（含10％小牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）将GC悬液调整为2×106/ml的单细胞悬液备用。置5％CO2，37℃培养箱内培养。
       2.3  颗粒细胞培养将4 ml GC悬液种入细胞瓶内，放入充5％CO2和95％空气的37℃恒温CO2孵箱中预培养24 h，随机分为正常对照组、模型组和宁心红杞含药血清组。随后在正常组加入0.5 ml正常对照血清和0.5 ml 的生理盐水；模型组加入0.5 ml 氯化镉和0.5 ml 正常对照血清；用药组加入0.5 ml 氯化镉和0.5 ml宁心红杞含药血清，继续培养24 h后收集GC，固定，待流式细胞仪及Capases-3的检测。
       2.4  衰老模型的制备张文昌等［5］研究表明镉有明显的雌性性腺毒性。用氯化镉（其终浓度为40 μmol/L［6］）造模，将颗粒细胞随机分为无血清正常对照组及加氯化镉组，通过MTT比色实验法观察氯化镉溶液对颗粒细胞是否有损伤。
       2.5  caspases-3检测按说明书加入各种试剂，摇匀。选择405 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度OD值，再按标准曲线换算为浓度。
       2.6  统计学方法实验结果以±s表示，采用t检验分析，所有统计计算用SPSS11.5统计分析软件进行，以P＜0.05表示有差异，以P＜0.01表示有显著性差异。
       3  结果
       3.1  MTT比色实验模型组与正常对照组比较，氯化镉（其终浓度为40 μmol/L）对GC具有损伤作用，造模成功（P＜0.05）。见表1。
       表1  MTT比色实验结果（略）
       与正常对照组比较，1P＜0.05；n=8
       3.2  流式细胞仪检测的结果流式细胞仪结果显示，正常对照组未见凋亡；氯化镉组有较明显的凋亡现象，在DNA直方图上，G1峰前出现Sub-G1，即凋亡细胞所特有的凋亡峰。加入宁心红杞含药血清后凋亡峰明显降低（图1）。
       图1  流式细胞仪检测结果（略）
       3.3  caspases-3检测的结果氯化镉组GC的caspases-3蛋白的表达升高，与正常对照组比较有显著差异（P＜0.05），说明造模成功。加入宁心红杞含药血清后，与模型组比较，caspases-3蛋白的表达明显降低（P＜0.01）。
       表2  各组大鼠颗粒细胞中caspases-3水平（略）
       与正常对照组比较，1P＜0.05，与模型组比较，2P＜0.01；n=3
       4  讨论
       4.1  宁心红杞含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡的影响流式细胞仪是检测细胞凋亡的一种方法，应用FCM 进行DNA 含量分析。凋亡细胞DNA 被降解,小分子DNA 可以通过细胞膜逸出细胞外,凋亡小体也可带走一部分DNA ,因而凋亡细胞DNA 含量下降,由此导致对DNA 染料的染色能力下降,在G1峰前呈现亚二倍体峰,称亚G期峰或A峰。FCM 检测凋亡细胞快速、定量好,并可作多参数分析。其结果显示，正常对照组凋亡率很低，在DNA直方图上主峰只有一个，说明GC基本无增殖能力。模型组有较明显的凋亡的现象，在DNA直方图上，G1峰前出现Sub-G1，即凋亡细胞所特有的凋亡峰。说明氯化镉对其有损伤作用，此部分实验用氯化镉制备卵巢颗粒细胞衰老模型是成功的。加入宁心红杞含药血清后GC的凋亡峰明显下降，说明宁心红杞胶囊对氯化镉造成的损伤有保护作用，其可以通过抑制卵巢颗粒细胞的凋亡来延缓卵巢的衰老。
       4.2  宁心红杞含药血清对卵巢颗粒细胞caspases-3的影响近年来，随着对卵巢生理功能研究的不断深入，有证据表明卵泡闭锁和黄体退化是通过细胞凋亡完成的。细胞凋亡的发生最终依赖于caspaese家族凋亡蛋白酶的活化，它在细胞凋亡的执行过程中起关键作用［7］。 Caspase为一半胱氨酸蛋白酶家族，它对底物中天冬氨酸有特异性，它的活化是底物内部天门冬氨酸残基断裂所必须的。编码Caspase的基因与线虫遗传学中定性的凋亡基因具有同源性。现已发现在小鼠和母牛卵巢颗粒细胞和黄体细胞中有caspase-1和caspase-3表达。最近，Izawa等［8］用逆转录多聚合酶链反应(RT-PCR)证实了颗粒细胞中caspase-1, caspase-3、凋亡相关蛋白酶激活因子-1, DNA断裂因子等基因转录物的存在，同时Western印迹证实了caspase-1,caspase-3蛋白前体的存在。体外非细胞系统研究也提示，凋亡相关蛋白酶激活因子-1, caspase-3及DNA断裂因子是一活化的凋亡级联反应的组分，其能导致凋亡细胞基因组DNA的特异性降解。人卵巢颗粒细胞可能也同样存在着凋亡相关蛋白酶激活因子-1激活caspase-3，从而依次活化DNA断裂因子以诱导基因组DNA断裂的凋亡机制。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切(激活或灭活)。它广泛分布于各种不同类型的细胞中，以无活性的前体形式存在，分子量为32 000。本实验结果显示，caspase-3蛋白在模型组表达较高，且颜色较深，与正常对照组相比有显著差异（P＜0.05），说明用氯化镉造模成功，加入宁心红杞含药血清后，其表达明显降低，与模型组比较有极显著差异（P＜0.01），说明宁心红杞含药血清抑制卵巢颗粒细胞凋亡可能与caspases-3有关。
       
       综上所述，宁心红杞含药血清能明显抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，其机制可能与caspases-3有关。
       【参考文献】
         　　［1］ Tilly JL.Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive［J］. Nat Rev. Mol， Cell Biol,2001,2（11）:838.
       
       ［2］ Johnson AL. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles［J］. Anim. Reprod. Sci,2003,78（3～4）：185.
       
       ［3］ 马 红,吕 哗,孙 浩，等.立春胶囊治疗女性围绝经期综合征74例临床观察［J］.天津中医,2002,19(4)：55.
       
       ［4］ 韦 澄,徐昌芬,马 红，等.宁心红杞胶囊对围绝经期综合征的治疗作用［J］.药学进展,2004,28(11)：521.
       
       ［5］ 张文昌,李煌元,王章敬，等.镉对大鼠雌性性腺与肾脏毒性比较研究［J］.中国公共卫生,2002,18(6)：693.
       
       ［6］ 贾梅梅,张文昌,陈 昱，等.镉对大鼠卵巢颗粒细胞孕激素合成的影响研究［J］.中国预防医学杂志,2007,8(4)：345.
       
       ［7］ 徐晓娟,金沈锐,秦旭化，等.补经合剂对初老大鼠卵巢细胞Fas，Caspases-3表达的影响［J］.中国中西医结合杂志,2003,23(6)：193.
       
       ［8］ Izawa M,Nguyen PH,Kim HH,et al. Expression of the apoptosis-related genes, cas pase-1, caspase-3, DNA fragmentation factor, and apoptotic pzotease activating factor-1, in hurman granulosa cells［J］. Fertil Steril,1998,70(3): 549.