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       【摘要】 
       目的用乙醇提取螃蟹脚中总黄酮的最佳工艺。方法比较超声提取和回流提取实验，用比色法测定有效成分；采用回流提取正交实验，并对实验数据经不同的计算和分析比较优选螃蟹脚的提取工艺条件。结果总黄酮提取率是超声提取低于回流提取；实验数据经不同的数据处理方式得到不同的优化工艺条件。通过验证实验可得到重复的实验结果。结论实验结果用多元线性回归计算，可弥补正交极差、方差计算的不足，更有利于结果解释和工艺条件的优化。
       【关键词】  正交设计 螃蟹脚 黄酮 提取工艺
       Study on Optimum Extraction Processes of Flavonoids from Viscum articulatum Burm
       YANG Fengxian，XIANG Yibo，FENG Xiaofei，LIU Xiangyi*
       （Southwest Forestry College，Kunming， 650224, China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of total flavonoids with alcohol from Viscum articulatum Burm. MethodsCompared with the ultrasonic extraction and the refluent extraction experiment，colorimetric analysis was used to measure the content of active ingredients. Besides，orthogonal design of the refluent extraction was applied to optimize the technologies of Viscum articulatum Burm in comparison with two ways to deal with the experimental results.ResultsThe extraction rate of the total flavonoids of the ultrasonic was lower than that of the refluent extraction. Besides，the different optimum extraction processes could be obtained by different ways to deal with the experiment results but the same experiment results were found. ConclusionThe multivariate regression analysis can make up shortage of sense. The equation of regression is more helpful for explanation of result and optimum of preparation technology.
       Key words：Orthogonal design；  Viscum articulatum Burm；  Flavonoid；  Extraction process
       
       螃蟹脚（扁枝槲寄生）Viscum articulatum Burm系桑寄生科槲寄生属植物，是一种寄生在树龄较高的古乔木茶树上的寄生物。螃蟹脚为多年生草本，形状像小珊瑚，因寄生枝杆节状带毫，故此被称为“螃蟹脚”。在缅甸，由于其特殊的地理位置和生态环境，千年古茶园里的古茶树上就寄生着“螃蟹脚”。主治风湿痹痛、腰膝酸软、胎动不安，与《中国药典》收载的“槲寄生”Viscum coloratum （Kom.）Nakai具有同等功效［1］，同时还具有降压、抗心律失常、增加冠脉流量、改善冠脉循环、增强心脏收缩力、抗肿瘤、治疗肝炎等作用［2］。对于槲寄生属的研究，国内已对寄生在柿、栗、榆、桦、柳、枫、杨等树上的有报道和专利［3～4］，但迄今未见对寄生在缅甸茶树上的螃蟹脚提取工艺优化研究的报道。
       
       经研究,槲寄生属的主要有效成分为黄酮类化合物和一些高分子化合物［3～4］，黄酮类化合物广泛存在于植物中，具有抗肿瘤、增强心血管功能、抑菌、抗病毒等作用，同时它还是一种天然的抗氧化剂［5］。本文以乙醇为溶剂，采用超声提取和回流提取两种方法，以总黄酮得率为指标进行比较。然后对回流提取的正交实验设计优选出螃蟹脚的最佳提取工艺，并对实验数据进行了极差、方差计算，经直观分析以及多元线性回归分析，计算机程序计算处理两种方法所优选工艺条件的比较，为合理筛选螃蟹脚的提取工艺提供科学依据。
       1  仪器与试剂
       
       　　UV-22201型紫外分光光度计（日本岛津公司），KESP-100KH超声波萃取器（深圳市科工达超声公司）。
       
       螃蟹脚采自缅甸，并经西南林学院资源学院植物学教研室鉴定。
       
       芦丁（供含量测定用），由中国医药（集团）上海化学试剂公司提供，所用试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  超声提取和回流提取的比较取3 g样品，在50℃条件下以乙醇为提取溶剂，固液比1∶5。超声提取3次，30 min/次；回流提取3次，2 h/次。3次提取液分别合并至50 ml容量瓶中，并用相应浓度的乙醇定容至刻度，使其作为供试品溶液。
       2.2  正交实验（回流提取）供试品溶液制备  按文献［4］的方法进行研究。
       2.3  总黄酮的测定
       2.3.1   标准曲线的制备  按文献［5］方法，以50%乙醇溶液为空白，测定吸收度，得回归方程为A=10.395C+0.015 7，r=0.999 9。
       2.3.2  含量测定方法  取上述供试液，按文献［5］方法进行研究，计算即得总黄酮的含量。
       2.3.3  正交实验显色稳定性取上述供试液按文献［6］方法进行研究：RSD= 0.97%，t n = 3h。加样回收率的测定：X=99.07%，RSD =3.75%，n=9。
       2.4  超声提取和回流提取总黄酮结果见表1。
       表1  超声提取和回流提取总黄酮的结果（略）
       由表1可知，回流提取螃蟹脚总黄酮得率高于超声提取。
       2.5  回流提取正交实验及结果  根据初步预实验的结果，拟用3因素3水平（表2），按L9（33）正交实验表对螃蟹脚进行回流提取实验，结果见表3。
       2.5.1  实验结果数据处理  极差方差计算结果见表3。
       表2  正交设计因素水平（略）
       表3  正交实验结果（略）
       多元线性回归计算［7～8］由于正交设计因素间彼此正交，即因素间的相关系数rij=0本试验设计的相关系数矩阵见表4，符合多元线性回归对因素的要求。因此，试验结果数据可采用多元线性回归计算处理，结果见表5。
       表4  相关系数矩阵结果（略）
       以总黄酮含量为指标y，回归方程如下：
        
       ^y=1.665 0-0.533 3A+0.001 1B-0.028 3C；
       
       N =9  R =0.643 8  F=1.179 6  S=0.083 5   F0.1（3，5）=3.62
       
       该回归方程线性不显著。计算结果显示：温度在40～80℃的变化对结果影响不大，可视为常量，为此删去因素B。
       表5  正交实验结果用多元线性回归处理（略）
       误差*：指相对百分误差=(y- ^y/y)×100%。y：指标实测值， ^y：回归计算值
       
       此外^y指标中有№1、№5等试验误差较大，影响了回归方程的线性显著性，为此删去这两点，结果见表6。
       
       以总黄酮含量为指标y，回归方程如下：
        
       ^y=1.908 7-0.862 8A-0.010 9C；
       
       N =7  R =0.913 1  F=10.032 7  S=0.043 8  F0.05（2，4）=6.94
       
       回归方程线性很显著。主要影响因素是A，其次是C。
       2.5.2  计算结果及工艺优化
       2.5.2.1  工艺优化根据正交设计极差方差计算结果：极差R的大小显示影响因素的主次。由表2数据与表3结果表明，在设置水平内，以螃蟹脚总黄酮含量为指标，影响因素顺序为A＞C＞B，但RA，RB，RC又较接近。以总黄酮含量直观分析，因素的最佳组合应为A1B2C2，即45%乙醇在60℃条件下回流提取3次，2 h/次。
       
       验证实验：取3g螃蟹脚按正交设计实验直观分析总黄酮含量的优化工艺为A1B2C2，以总黄酮为指标进行考察，3次实验结果见表7。
       表6  正交实验结果用多元线性回归处理（略）
       “*”同前述，“**”表示被删去的样品号
       表7  正交实验结果用多元线性回归处理（略）
       由表7可见优化提取条件3次实验均能达到正交实验表中结果的较高值。
       2.5.2.2  多元线性回归计算分析结果讨论及工艺优化：删去因素B及误差点后，回归方程线性显著，因此可根据回归方程进行结果解释和工艺优化，A因素是主要影响因素，与极差方差计算结果吻合，表明螃蟹脚在提取过程中组织内的浓度与外周溶液的浓度差异大，扩散推动力越大，越有利于有效成分的溶出。提取温度在40～80℃间的变化对指标影响较小。综合考虑且结合生产实际，固定B=60℃，确定螃蟹脚提取的优化条件为提取温度为60℃，45%的乙醇回流提取3次，1 h/次，代入回归方程。
       
       验证实验：取3 g螃蟹脚，按多元回归方程优化条件进行验证，提取液按前述含量测定方法测定总黄酮含量，并与回归方程预测值比较，3次实验结果及预测值见表8。
       表8  验证实验（略）
       实验结果显示，螃蟹脚总黄酮含量3次实验值均高于正交设计预测值，表明回归方程能描述本提取工艺系统，优化是成功的。
       3  结论
          
       通过超声提取和回流提取两种方法比较：回流提取螃蟹脚总黄酮得率高于超声提取。
       
       对回流提取实验采用两种不同的数据处理方式得到的优化工艺条件不同，分别是：极差、方差优化工艺条件为45%乙醇在60℃条件下回流提取3次，2 h/次；而多元线性回归优化工艺条件为45%乙醇在60℃条件下回流提取3次，1 h/次。
       
       由实验数据处理结果显示出采用极差、方差有如下不足：极差计算只依赖于指标值，无法判断实验点的误差大小，此外在进行工艺优化时只能从正交设计表中找出最好点的实验条件作为优化条件，未必是真正的优化条件。但若采用多元线性回归计算，可弥补正交极差、方差计算的不足。而回归方程既能明确每个因素对指标的影响，又可判断实验点的实验误差。因而，更有利于结果解释和工艺条件的优化，较之单纯的极差、方差分析更为明显、可靠。
       【参考文献】
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