文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的评价去甲斑蝥素-海藻酸/聚酸酐微球（NA/PMs）的肝动脉栓塞作用及其安全性。方法在DSA下对新西兰大白兔行肝动脉造影注入NA/PMs，观察NA/PMs对兔肝动脉栓塞作用；进行NA/PMs小鼠急性毒性试验和大鼠肝动脉介入实验，评价NA/PMs对两种动物的毒性作用。结果兔肝动脉栓塞前，肝脏血管造影清晰，栓塞后10 min造影，远端微血管消逝，肝动脉增粗、迂曲，3 d时可见肝脏轻微肿胀，7 d后肿胀明显减轻，14 d出现小片状梗死灶。急性毒性实验显示，NA/PMs组小鼠的死亡率和肾毒性明显低于去甲斑蝥素组（P<0.05），且无其它明显的脏器损害。大鼠肝动脉介入给药后，病理切片显示NA/PMs栓塞于肝窦前小动脉，且栓塞后出现一过性肝功能损害，AST，ALT均在栓塞后1 d达峰值，以后逐渐下降，7 d左右恢复正常水平(P>0.05)。栓塞后白细胞出现一过性升高，第3天达峰值，第7天接近正常水平(P>0.05)。结论去甲斑蝥素-海藻酸/聚酸酐微球具有良好的肝动脉末梢栓塞作用，且微球制剂能明显降低去甲斑蝥素的体内毒副作用。
       【关键词】  去甲斑蝥素 海藻酸/聚酸酐 微球 动脉栓塞 急性毒性
       Effect of Norcantharidin Controlled Release Microspheres on Embolization of Hepatic Artery and Experiment of Acute Toxicity
       ZHOU LiHong, LI Qi *,  FAN Zhongze,LIU Xiaohua, PAUL Heng,WANG Yan
       （Department of Tumor, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Shanghai 200062, China.; National University of Singapore，Singapore 117543,China）
       Abstract：ObjectiveTo evaluate the effect of Norcantharidin Alginate /PLGA Microspheres on embolization of hepatic artery and it"s safety.MethodsUnder digital subtracted angiography(DSA), hepatic angiographies were performed in New Zealand white rabbits with injection of norcantharadin microspheres via hepatic artery, to observe the effect of NA/PMs on embolization of rabbit hepatic artery. Meanwhile, to perform acute toxicity experiment on mouse and intervention experiment on rat hepatic artery of NA/PMs, then to evaluate it"s safety on two animals. ResultsBefore hepatic embolization，the angiographic images showed clear delineation of hepatic vessels. The disappearance of distal microvessels with thicker and twisted hepatic arteries occurred at 10 min after the emblization. Little swelling of liver after was appeared on 3rd day, lightened obviously on 7th day, and infarct focus in fragmentis was presented on 14th day. Acute toxicity experiment exhibited that mortality and nephrotoxicity of the NA/PMs group is lower than NCTD group obviously(P<0.05), and haven"t conspicuous other organ damage. After interventional administration via hepatic artery to rat, the pathological analysis revealed that the microspheres were mainly present in presinusoidal arterioles after the embolization. The transient liver function damage occurred after embolization with both AST and ALT, reaching the peak levels on the 1st day. which decreased gradually and then returned to normal on 7th day(P>0.05). Simultaneously，the transient elevation of white blood cells occurred， approaching the peak level on 3rd day and back to the normal on 7th day (P>0.05).ConclusionNA/PMs possesses a better embolitic action on the terminad hepatic arteries，and it"s microsphere praeparatum could degrade internal toxicity.
       Key words： Norcantharidin;   Alginate/PLGA;   Microspheres;   Arterial Embolism;   Acute Toxicity
       
       药物微球是近年来新兴的靶向控释制剂，具有栓塞肿瘤血管、主动靶向和控释药物等作用，能够延长药物的作用时间，提高局部药物浓度，降低全身毒性等作用［1～4］。采用乳化-化学交联法制备去甲斑蝥素微球，体外抗肿瘤实验显示对肿瘤细胞具有很好的杀伤作用。为进一步研究去甲斑蝥素微球的作用，以正常兔为实验对象，探讨NA/PMs血管栓塞作用，采用小鼠腹腔给药和大鼠肝脏介入给药两种途径，探讨NA/PMs给药后的毒性反应。为去甲斑蝥素微球-海藻酸/聚酸酐微球介入治疗肿瘤提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物清洁级昆明小鼠80只，雄性，体重20～25 g；普通级SD大鼠54只，雄性，体重（200±250）g；雄性新西兰大白兔18只，体重（2000±100）g，均购自中科院上海实验动物中心。
       1.2  药物与试剂去甲斑蝥素（NCTD）购自山东平原制药厂，纯度为98.5%（批号：0312072），以生理盐水加热至50℃溶解，配制成所需浓度后，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用。去甲斑蝥素微球（NA/PMs）、空白微球(B-MS)采用化学交联法制备，微球粒径为40～100 μm，平均粒径（46.9±5.4） μm ，NA/PMs中去甲斑蝥素含量为4.3%左右。盐酸氯胺酮注射液 2ml：0.1g，上海中西药业股份有限公司新冈制药厂，国药准字H31022247。0.5%羧甲基纤维素生理盐水（NaCMC）上海医药工业研究院配制。
       1.3  仪器SSW-3显微外科手术器械包（上海手术器械厂）；眼科手术器械（苏州医疗器械厂）；MA-110电子天平（上海第二天平仪器厂）；数字减影血管造影机（DSA菲利普公司）；普通光学显微镜CX31（OLYMPUS）；JUNGRM-203切片机 ，OLYPUSBX-60万能显微镜摄像机；全自动生化血液分析仪（Beckman公司）Q/1YS002多用途水浴恒温箱；TCL-26G台式高速离心机；80-2离心沉淀器；电热恒温培养箱等。
       2  方法
       2.1  兔肝动脉介入栓塞实验参照文献［1］的肝动脉插管方法，兔术前禁食12 h，禁水2 h，以25 mg/kg剂量后大腿肌肉注射盐酸氯胺酮注射液，20 min左右实验动物进入麻醉状态。将实验兔四肢固定在手术台上，耳缘静脉静注5%葡萄糖注射液250 ml+安定注射液2.5 mg/kg +庆大注射液1ku/kg持续麻醉。剪去腹部的兔毛，暴露出皮肤，用碘酒消毒。DSA下，无菌条件下，在剑突下沿腹白线切开5 cm左右，将胃向左外完全翻出，并向上翻开左肝叶，暴露肝胃韧带并剪开，充分暴露肝门区，分离胃十二指肠动脉、肝总动脉和肝固有动脉。结扎胃十二指肠动脉远端，动脉夹暂时阻断肝总动脉，在胃十二指肠动脉上作一小切口，由此插入外径为1 mm的自制硅胶导管，上行至肝固有动脉，用9-0缝合线固定，回血后，注入造影剂，注入造影剂的速度约0.1～0.2ml/s，连续摄片。造影后以8 mg/kg剂量注入NA/PMs 2ml。注射完后，拔除导管并结扎胃十二指肠动脉近端，放开肝总动脉上的动脉夹，逐层缝合、消毒。
       
       实验兔18只，栓塞后20 min，1 ，7 ，14 ，21 ，30 d后各取3只再次造影，观察肝动脉栓塞情况；并处死，取心、肝、肾、脾、肺等组织，10%的福尔马林溶液中固定，HE染色观察病理变化。
       2.2  小鼠腹腔注射给药的急性毒性实验将清洁级环境下饲养的昆明小鼠80只随机分为4个组，每组20只，各组一次性腹腔注射给药，各组药物及剂量见表1，其中去甲斑蝥素组和去甲斑蝥素微球组所含药物相当于临床成人推荐剂量的28倍。
       表1  动物分组及药物剂量（略）
       给药后，观察4周内包括观察小鼠外貌和行为状况，食物消耗量，体重变化等一般情况；观察4周内各组小鼠的中毒反应及死亡率。4周后处死全部小鼠，肉眼观察腹腔内变化和药物残留情况；取血检测血常规和肝、肾功能。取心、肝、肾、脾、脑、肺等组织送病理检查。
       2.3  大鼠肝动脉介入给药的毒性反应实验大鼠肝动脉介入方法参照文献［5］肝动脉插管介入方法，具体方法同“2.1项”，大鼠72只随机分为4组。
       表2  肝动脉介入分组及药物剂量（略）
       各组肝动脉介入给药后1，3，7，14 d，作肝、肾功能、血常规检查；灌注后1 ，3 ，7 ，14 ，21 ，30 d各处死5只，切取肝、肾、脾、肺、心脏，置于10%的福尔马林液中固定，常规石蜡包埋，HE染色，作病理切片。
       2.4  统计学处理应用统计软件SPSS13进行数据统计分析，所得每组数据值±s表示，组内差异性检验用方差分析，统计学采用t检验，以P<0.05为具有统计学意义。
       3  结果
       3.1  去甲斑蝥素微球微血管栓塞作用兔肝血管栓塞前，肝脏血管造影清晰，栓塞后10 min造影，远端微血管消逝，由于远端血管栓塞，肝动脉增粗、迂曲。介入栓塞后30 d造影远端血管仍未显影（见图1～2）。提示去甲斑蝥素微球栓塞时间在1个月以上。
       图1  肝动脉栓塞前（略）     
       图2  肝动脉栓塞后30d（略）
       
       肝脏病理结果显示，微球大多栓塞于肝窦前小动脉，HE染色下NA/PMs呈粉红色，一般一粒微球将血管腔完全阻塞，少部分血管腔一侧留有空隙（见图3）。栓塞后1 d，被阻塞的动脉周围有大量淋巴细胞浸润，微球表面和动脉血管腔有红细胞粘附瘀积，被栓塞的动脉扩张，3 d后被栓塞的动脉血管壁水肿管壁增生增厚。7d被栓塞血管的炎性反应减轻。14 d可见微球被巨噬细胞吞噬以及自身降解呈现不规则的形状以后随着时间的延长，动脉内的微球逐渐被吞噬、降解，但末梢动脉在30 d时仍可见栓塞的微球。肺、脾、肾、心脏等器官未见有微球栓塞。NA/PMs组和B-MS组对肝血管栓塞的病理表现无明显差别。
       图3  栓塞后病理切片（略）
       3.2  各组兔灌注后相关脏器病理改变
       3.2.1  大体改变NS组灌注后肝脏及其他脏器无明显变化，NA/PMs介入栓塞后可见肝脏轻微肿胀，NA/PMs和B-MS组肝脏颜色变淡，部分肝叶边缘出现黄色梗死灶。
       3.2.2  镜下改变NA/PMs栓塞后1，3 d 汇管区肝组织及部分肝窦表现为急性炎性反应，大量淋巴细胞浸润。1，3 d可见少数肝细胞浊肿水样变和小片状坏死，坏死仅在被栓塞血管的汇管区，肝窦充血，同时可见门静脉扩张。以上变化3 d时最明显。7 d后肝细胞浊肿明显减轻。兔肝脏栓塞14 d，可见小片状坏死灶，仅汇管区有少量炎性细胞浸润，21 d坏死的肝细胞胞浆凝固，纤维肉芽增生（见图4～7）。心、脾、肾等其它脏器未见明显改变。
       图4  正常兔肝脏（HE 40×）（略）  
       图5  栓塞后3d（HE 100×）（略）
       图6  栓塞14d （HE 40×）（略）  
       图7  栓塞21d（HE 100×）（略）
       3.3  小鼠急性毒性实验结果
       3.3.1  给药后一般情况NCTD组：给药后数分钟多数出现扭体，躁动，给药后第1天出现萎靡少动，皮毛蓬乱等毒性反应，第2天好转，第4天恢复正常； NA/PMs组：给药后第1天少部分小鼠出现萎靡少动，皮毛蓬乱等毒性反应，第3天恢复正常。空白微球组注射后数分钟内个别动物出现躁动等反应。给药后第1天 NCTD组和NA/PMs出现食量明显下降，显著低于对照组（P<0.001），给药后第2天NA/PMs恢复正常，NCTD组食量明显低于其他两组（P<0.005）。给药后第3天起，各组的食物消耗量无显著差异（P>0.05），如图8所示。3组存活动物3天后逐渐恢复正常，反应敏捷，眼睛有神，皮毛浓密而有光泽，肌肉丰满，尾不弯曲，粪便呈颗粒状。一般行为活动、食量和粪便等均正常，一般体征良好。
       图8  各组小鼠给药后饲料消耗比较（略）
       3.3.2  给药前后的体重变化 各组小鼠的体重随时间的延长而增加。除NCTD组实验1周后体重增长速度明显低于其他各组外（P<0.05）和对照组（P<0.001）外，其他时间体重增长速度各组间无显著差异，各组小鼠的体重随时间的延长而增加（见图9）。
       图9  各组小鼠体重比较（略）
       3.3.3  小鼠死亡情况NCTD组20只小鼠，腹腔注射给药后死亡6只；NA/PMs组20只小鼠腹腔注射后死亡1只，两组间死亡率的差异有显著性意义（P<0.05），空白微球组无死亡。两组小鼠死亡均发生在给药后第1天内，在第2天后均未再出现死亡。
       3.3.4  小鼠给药后脏器病理变化解剖各实验组小鼠未发现腹腔内异物残留。肝、肾、心、肺等脏器表面及腹膜表面光滑、色泽正常，未见异常现象。石蜡切片、HE染色发现NCTD组8.0mg/kg腹腔注射4周后，肾组织局部小片状坏死，细胞形态消失，肾小管上皮细胞充血、水肿、变性明显，管腔狭窄; 心肌细胞出现轻度浊肿，未见明显的坏死。NA/PMs组肾间质水肿，肾小管细胞充血、水肿，但比NCTD组明显减轻，心脏无明显病理改变，B-MS组心肾无明显病理改变，3组各实质性脏器肝、脑、脾、肺与生理盐水相同，均无病理改变（见图10～14）。
       图10  正常小鼠肾脏（略）       
       图11  NCTD组给药后肾脏（略）
       3.4  大鼠介入后相关脏器病理改变
       3.4.1  大体改变 NS组介入给药后肝脏及其他脏器无明显变化，其余3组介入给药后1d可见肝脏轻微肿胀，NA/PMs和B-MS组肝脏颜色变淡，部分肝脏边缘有黄色梗死灶。
       图12  NA/PMs组给药后肾脏（略）   
       图13  正常小鼠心脏（略）
       图14  NCTD组心脏（略）
       3.4.2  镜下改变NA/PMs组：灌注后1，3d 汇管区肝组织及部分肝窦表现为急性炎性反应，大量淋巴细胞浸润。1，3d可见少数肝细胞浊肿水样变和小片状坏死，坏死仅在被栓塞血管的汇管区，肝窦充血，同时可见门静脉扩张。以上变化3d时最明显。7d后肝细胞浊肿明显减轻，21，30d仅汇管区有少量炎性细胞浸润，坏死的肝细胞胞浆凝固，纤维肉芽增生。心、脾、肾等其它脏器未见明显改变。B-MS组灌注后病理改变与M-MS组基本相同。NCTD 组：灌注后1d肝细胞浊肿水样变，周围有大量分叶核、淋巴细胞浸润，无明显的肝细胞坏死，以上改变1d时最明显，3d 后开始减轻，其他脏器未见明显变化，见图15～16。
       图15  正常肝组织（略）       
       图16  NA/PMs介入7d后肝组织（略）
       3.4.3  肝动脉介入给药对肝功能、生化指标、血象的影响介入后NA/PMs组、B-MS组大鼠血清AST，ALT较盐水组明显升高（图17～19）。NAPM组、B-MS组AST，ALT均在介入给药后3d达最高值，14 d左右接近正常水平。NCTD组AST、ALT在介入给药后1d略升高，但与治疗前和生理盐水组相比均无统计学意义（P>0.05）。NA/PMs和B-MS组WBC均在给药后24 h达最高值。NCTD组WBC在介入后在3 d达最高值，三组WBC均在7d时接近术前正常水平；生理盐水组ALT、AST也较灌介入前升高，但其差异无统计学意义。NA/PMs组和空白微球组在各个时间点的AST，ALT，WBC值无显著差异（P>0.05）。其他ALP，γ-GT, ALB，Cr，BUN，Hb，RBC，T-Pro，Tbil，PLT等在各个时间点4组之间无明显差异（P>0.05）。
       图17  各组大鼠肝动脉灌注后对ALT的影响（略）
       图18  各组大鼠肝动脉灌注后对AST的影响（略）
       图19  各组大鼠肝动脉灌注后对WBC的影响（略）
       4  讨论
          
       药物微球（Drug Microsphere）是近年来研制的一种新剂型，国内外已有丝裂霉素、阿霉素等多种含药微球问世［6，7］。研究表明药物微球能栓塞至末梢血管，与常规栓塞剂相比栓塞后侧支循环不易形成，癌组织坏死更彻底，在发挥栓塞作用的同时，微球中的药物在肿瘤局部持续缓释，使局部保持较高的药物浓度，减轻了常规介入所用化疗药的骨髓和免疫抑制、肝肾功能损害等全身毒副反应，具有控释、栓塞、靶向的多重功效［7，8］。
       
       去甲斑蝥素是斑蝥素去甲基化衍生物，抗癌作用进一步增强，泌尿系等毒性明显减轻。其抗癌谱广，现已人工合成，是我国首先合成的抗肿瘤药物。主要用于消化系统肿瘤，尤其是肝癌的治疗。其抗癌机理是干扰癌细胞的DNA及蛋白质合成，诱导细胞凋亡，同时又具有升高白细胞，保护肝功能和免疫调节等作用。但去甲斑蝥素微溶于水，且血管刺激性大，很难静脉给药，口服生物利用率低；近年来，国内有学者将去甲斑蝥素制备成缓释剂应用于临床肝癌病人的局部注射治疗［9］，发现其局部注射治疗肝癌可提高患者生存质量，但剂量增大时仍有一定的毒副作用，从而限制了它在肝癌临床治疗上应用。已经发现，去甲斑蝥素的细胞毒作用随着药物浓度的增加及作用时间的延长而增强［10］，所以如何加大剂量、延长其作用时间而同时又不增加毒副作用则是增强临床疗效的关键问题。
       
       鉴于去甲斑蝥素临床给药的局限性，不能大量应用于临床上肿瘤的治疗，同时结合药物微球的具有控释、靶向等特性，我们将NCTD制剂制备成去甲斑蝥素-海藻酸/聚酸酐微球（NA/PMs），并对其进行了药效研究，发现NA/PMs经肝动脉介入给药后对大鼠肝癌具有较好的治疗作用，其作用机制与栓塞肿瘤微血管、缓慢释放NCTD、诱导肿瘤细胞凋亡和下调Ki-67的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖有关［11］。为了进一步探讨其在临床上应用的可行性，本研究将NA/PMs进行肝动脉灌注，研究其在兔肝动脉及其它脏器组织中的栓塞作用。微球大多栓塞于肝窦前小动脉，且被阻塞的动脉周围有大量淋巴细胞浸润，栓塞的动脉扩张、血管壁水肿、管壁增生增厚，说明微球对动脉血管有一定的刺激性，给药初期能影响血管的形态，微球随着时间的延长在动脉内逐渐被吞噬、降解，但末梢动脉在30d时仍可见栓塞的微球。说明NA/PMs在兔肝动脉中具有良好的缓释效应，能明显延长药物的作用时间，从而达到药物的控释作用。
       
       按成人剂量28倍小鼠腹腔注射后由于去甲斑蝥素组药物浓度迅速达到峰值，病理可见肾组织局部小片状坏死，细胞形态消失，肾小管上皮细胞充血、水肿、变性明显，管腔狭窄，心肌细胞出现轻度浊肿。去甲斑蝥素微球组虽然也含有等量的去甲斑蝥素，但其中的去甲斑蝥素从微球中缓慢释放，峰浓度远比游离的去甲斑蝥素直接给药浓度低，所以NA/PMs组仅见肾间质水肿，肾小管细胞充血、水肿，且肾脏毒性低于NCTD组。心脏无明显病理改变，B-MS组心肾无明显病理改变。提示去甲斑蝥素制成微球肝动脉介入给药对全身具有明显的减毒作用。
       
       一般认为虽然肝组织主要由门静脉供血（约占75%），但在末梢动脉血流完全阻断情况下，侧枝循环不能建立，门静脉不能迅速有效地代偿，其供血不足以防止肝损害［12］；正常肝细胞血供虽然主要来自门静脉，但肝细胞代谢所消耗的氧则主要来自肝动脉［13］，去甲斑蝥素微球肝动脉灌注阻断肝动脉末梢后，一方面肝组织缺血缺氧，另一方面被巨噬细胞包绕，形成炎性反应。二者使肝细胞浊肿水样变甚至坏死，静脉回流受阻，门脉扩张。本实验表现为微球栓塞后，汇管区肝组织部分梗死和肝功能异常。去甲斑蝥素微球与空白微球栓塞后各个时相对肝功外周血象等的影响，经比较无显著差异，说明去甲斑蝥素微球在局部缓释的药物，不足以引起肝脏毒副反应。至于去甲斑蝥素微球制剂的肝动脉介入给药的药代动力学将有待于进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ Pradilla G，Wang PP，Gabikian P，et al．Local Intracerebral Administration of Paclitaxel with the Paclimer Delivery System：Toxicity Study in a Canine Model［J］.J Neurooncol，2006，76（2）：131.
       
       ［2］ Manunta ML，Gavini E，Chessa G，et al.Carboplatin sustained delivery　system using injectable microspheres［J］. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med，2005，52（8）：416.
       
       ［3］ Li Y，Jiang HL，Zhu KJ，Liu JH，et al.Characterization and nasal delivery of alpha-cobrotoxin-loaded　poly (lactide-co-glycolide)/polyanhydride microspheres［J］. J Control Release，2005，108（1）：10.
       
       ［4］ Muvaffak A，Gurhan I，Gunduz U，et al ．Preparation and characterization of a biodegradable drug targeting system for anticancer drug delivery：microsphere-antibody conjugate［J］.J Drug Target，2005，13（3）：151.
       
       ［5］ 李 琦，刘晓华，陈庆华.蜂毒素微球经动脉介入治疗大鼠肝癌的实验研究［J］.浙江中西医结合杂志，2004，14（2）：72.
       
       ［6］ Takeuchi I，Ishida H，Kuwabara K，et al．Audit of the safety of hepatic arterial infusion of degradable starch microspheres (DSM) Adriamycin (ADM) mitomycin C (MMC) on aged patients with liver metastases of colorectal cancer［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2002，29（12）：2374.
       
       ［7］ Sakamoto Y，Suzuki T，Yoshino H，et al．Anti-tumor effect of intraperitoneal administration of cisplatin-loaded microspheres to human tumor xenografted nude mice［J］.J Control Release，2002，80（1-3）：295.
       
       ［8］ Furuse J，Ishii H，Satake M，et al．Pilot study of transcatheter arterial chemoembolization with degradable starch microspheres in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Am J Clin Oncol，2003，26（2）：159.
       
       ［9］ 陈 坚，陈 喆，吕 鸣，等.去甲斑蝥素-泊洛沙姆407缓释制剂局部注射治疗原发性肝癌25例［J］.安徽中医学院学报，2000，19（1）：5.
       
       ［10］ 赵泽明，范跃祖，傅锦业，等.去甲斑蝥素对人胆囊癌侵袭转移的体内外抑制实验研究［J］.中华肿瘤杂志，2005，27（4）：221.
       
       ［11］ 李 琦，范忠泽，李先茜，等.去甲斑蝥素微球介入治疗大鼠肝癌疗效及其机制研究［J］.中西医结合学报，2006，4（4）：378.
       
       ［12］ Umeda Y，Yagi T，Sadamori H，et al．Effects of prophylactic splenic artery modulation on portal overperfusion and liver regeneration in small-for-size graft［J］.Transplantation，2008，86（5）：673.
       
       ［13］ 姚光弼.临床肝脏病学［M］.上海：上海科学技术出版社，2004：65.