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       【摘要】 
       目的研究日本医蛭不同萃取部位的抗凝活性，为日本医蛭的新药开发提供依据。方法SD大鼠腹主脉取血，应用血凝仪体外测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化的部分凝血活酶时间(APTT)。结果日本医蛭的总提物能使大鼠PT，TT，APTT时间显著延长；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延长。结论中药日本医蛭的低极性小分子具有抗凝活性。
       【关键词】  日本医蛭 抗凝血
       水蛭作为药用，历史悠久。在中国，水蛭始载于《神农本草经》，谓其能“逐恶血、瘀血”“破血瘕积聚”。临床广泛用于血栓形成、冠心病、脑水肿的治疗［1］。世界上蛭类有数百种，中国也有近百种。《中国药典》2005年版收载水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman、日本医蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman 3种［2］。现在公认水蛭的活性成分为水蛭素，它是从医蛭的唾液腺中提取出来的一种多肽，是作用很强的凝血酶抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。而中药传统应用炮制的水蛭入药，即水蛭要经过开水烫死晒干或砂炒，水蛭素完全被破坏［3，4］，然而水蛭的破血、通经的功效仍然得以保留，这说明水蛭中含有除水蛭素外的其它抗凝血成分。目前人们对水蛭中蛋白多肽类活性成分研究较多，如抗凝血物质水蛭素以及肝素、抗血栓素抗炎酶和溶血酶及组胺样物质［5］，而对小分子研究报道较少。有人研究了蚂蝗的不同极性小分子部位的抗凝活性，证明中等极性的小分子具有较强的抗凝活性［6］。本文报道日本医蛭不同萃取部位体外的抗凝活性，以期寻找其他有效的抗凝血小分子成分。
       1  材料与仪器
       1.1  动物 Sprague Dawley大鼠，雄性，体重200～250 g，购于中国科学院上海实验动物中心，合格证号SCXK（沪）2002-0010。饲养环境为清洁级，合格证号SYXK（苏）2002-0007。
       1.2  药材 日本医蛭购于江苏省宿迁市保安养蛭场，为鲜品经太阳直接晒干而成，经李友宾博士鉴定为Hirudo nipponia Whitman，标本保存于江苏省中医药研究院中药化学室，标本号2004-09-08。
       1.3  试剂 枸橼酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂，批号20020912）；水合氯醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T20060922）；TT，PT，APTT试剂（上海希森美康医用电子有限公司，产品标准号ZB/Dade Behing-04-2002。
       1.4  仪器 普利生PLSC2000-4型血小板聚集凝血因子分析仪。
       2  方法
       　　
       2.1  样品液的制备日本医蛭干品，加8倍量95％的乙醇回流提取3次，1.5 h/次。合并3次提取液，减压挥去溶剂得到总提物。将总提物分散于水中，分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取（正丁醇萃取后剩下的部分为水部位），各萃取物挥去溶剂分别得到石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部分。分别称取总提取物2 g，石油醚部位1.1 g，氯仿部位0.044 g溶解于10 ml的二甲亚砜中，正丁醇部位0.754 g，溶于10 ml 3％吐温，水部位0.646 g溶于10 ml生理盐水，使各部位样品液浓度均为830 mg生药/ml。
       2.2  凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的测定选用SD雄性大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3 000 r/min，离心15 min，取血浆100 μl，加入药液10 μl，预温3 min后加入预温好的PT，TT试剂200 μl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。
       2.3  活化的部分凝血活酶时间(APTT)的测定按“2.2”方法分离出血浆，取血浆100 μl，加入10 μl药液和APTT试剂100 μl，预温3 min后加入预温15 min的CaCl2100 μl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。
       2.4  统计方法 统计方法用One-way-ANOVA，多组间两两比较，用LSD(Least-Signfieant-Diference)统计。
       3  结果
       3.1  日本医蛭提取部位的抗凝血活性结果见表1～3。结果表明，总提物能使大鼠PT，TT，APTT时间显著延长；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延长。经SPSS软件单因素方差分析，日本医蛭总提物、石油醚部位抗凝活性作用明显强于其他提取部位。
       表1  日本医蛭总提物、石油醚部位、氯仿部位对大鼠PT，TT，APTT的影响（略）
       与二甲亚砜比较， *P<0.05；n=4
       表2  日本医蛭水部位对大鼠PT，TT，APTT的影响（略）
       表3  日本医蛭正丁醇部位对大鼠PT，TT，APTT的影响（略）
       3.2  提取物浓度与抗凝血活性的关系总提物和石油醚部位的浓度越高其抗凝血作用越强。在实验范围内，总提物的浓度与PT，TT，APTT凝血指标的延长呈线性关系。见图1～2。
       图1  总提物浓度与凝血活性之间的关系（略）
       图2  石油醚部位浓度与凝血酶原时间之间的关系（略）
       4  讨论
          
       凝血过程是一系列的酶促反应，包括内源性，外源性凝血系列和共同途径。凝血酶原时间（PT），活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶时间（TT）分别反映了外源性凝血系统和内源性凝血系统的活性。其中，APTT测定是内源性凝血系统各凝血成分总的凝血状况的筛选实验；PT测定是外源性凝血系统各凝血成分总的凝血状况的筛选实验；而TT测定是检查血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白能力的过筛实验［7］。体外抗凝活性测定结果表明，日本医蛭总提物能延长APTT，PT，TT时间，说明日本医蛭饮片中存在对内源性，外源性凝血系统和共同途径产生抗凝作用的有效物质。进一步按照总提物中分子的不同极性用不同极性的有机溶剂萃取，分成石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部位。其中石油醚部位有明显的抗凝血活性，延长PT、APTT时间，且抗凝血作用与浓度成正相关，说明日本医蛭抗凝成分除了水蛭素外，还有低极性的小分子物质。这和文献［6］报道蚂蟥的抗凝成分主要为中等极性分子有一定出入。也有人报道［8］水蛭粗粉经甲醇提取后用不同极性的有机溶剂萃取，其中脂溶性部分表现有较强的抗凝血活性，因此可以肯定的是水蛭中除了蛋白多肽等水溶性抗凝活性成分外，还存在低极性的小分子抗凝活性成分。至于是何种具体成分及其作用机理有待更进一步的研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 谭毓治，徐 彭，张孝友，等.去头水蛭醇提物抗血栓作用的研究［J］.中国中药杂志，1999，24（10）：622.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：57.
       
       ［3］ 中国药用动物志［M］.天津：天津科技出版社，1979：8.
       
       ［4］ 贾元印.水蛭中抗凝血物质的提取及药理实验［J］.山东医药工业，1990,9(1)：1.
       
       ［5］ 潘 贺，刚宏林，苏云明. 中药水蛭的活性成分及药理作用研究概况［J］.中医药信息，2006，23（1）：20.
       
       ［6］ 李艳玲，黄荣清，孙晓东.水蛭不同提取物抗凝活性的体外实验研究［J］.中药材，2004，27（2）：123.
       
       ［7］ 王学峰，王鸿利．血栓与止血的检测及应用［M］.上海：世界图书出版公司，2002：164.
       
       ［8］ 黄荣清，骆传环，彭江南，等.水蛭中小分子活性成分的GC-MS研究［J］.中草药，2003，34（9）：788.