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       【摘要】 
       目的探讨三叶黄合剂对正常小鼠和免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。方法用三叶黄合剂给正常小鼠和环磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠灌胃，然后用称重法检测小鼠胸腺、脾重量，用中性红比色法检测巨噬细胞活性，用RIA法检测白细胞介素-2（IL-2）含量，用MTT法检测NK细胞活性和T淋巴细胞增殖功能。结果三叶黄合剂对正常小鼠胸腺、脾重量和细胞免疫功能无显著影响，对CTX的免疫抑制作用有显著的抵抗作用，能增加免疫抑制小鼠胸腺和脾的重量，增强巨噬细胞的吞噬作用，促进IL-2分泌，增加NK细胞活性和T淋巴细胞增殖功能。结论三叶黄合剂对正常小鼠的细胞免疫功能无显著影响，但能抵抗CTX对小鼠细胞免疫功能的抑制作用。
       【关键词】  三叶黄合剂 巨噬细胞 白细胞介素-2 T淋巴细胞 NK细胞
       三叶黄合剂是根据中医基本理论及方剂组方原则提出的、以治疗乙型肝炎病毒感染为主的自拟方（以中药学家邓家刚教授为首的专家组拟定），由三姐妹、叶下珠、绞股蓝、黄芪、白术、田七等中草药制成，有解毒、利湿化瘀、益气健脾、扶正护肝之功。体外研究表明，三叶黄合剂对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg均具有一定的抑制作用［1］。为探索其对正常或免疫抑制小鼠细胞免疫功能有无调节作用，我们研究了三叶黄合剂对小鼠细胞免疫功能的影响。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  动物昆明种小鼠120只，雌雄兼用，体重（20±2）g，广西中医学院实验动物中心提供。
       1.2  药物与试剂三叶黄合剂，为三叶黄合剂水煎剂（低压浓缩至3.3 g生药/ml），4℃冰箱保存，应用时用蒸馏水配成所需浓度。MTT试剂盒：R＆D SYSTEMS产品；ConA（刀豆蛋白A），美国sigma公司产品；RPMI1640，美国GIBCO公司产品；IL-2试剂盒（125I-IL-2RIA），北京北方生物技术研究所产品；环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司产品；YAC-1细胞株：本院药理教研室保存；新生牛血清（NCS）：杭州四季青生物工程材料有限公司提供。
       1.3  仪器Multiskan MK3型酶标仪，美国Thermo公司产品；Forma 311型CO2培养箱，美国Thermo公司；FJ-2008P型γ放射免疫计数器，西安国营二六二厂产品；722型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品；AE260型电子天平，瑞士Mettler产品，B4i型离心机，美国Thermo公司产品。
       2  方法
       2.1   动物分组及给药方法实验动物随机分为12组，每组10只（其中6组用于检测胸腺、脾重量和巨噬细胞吞噬功能，6组用于检测其它指标）。第1组为对照组，用生理盐水灌胃，每鼠0.4 ml·d-1；第2组为药物对照组，每鼠用三叶黄合剂10 g·kg-1·d-1灌胃；第3组为模型组，用生理盐水灌胃，每鼠0.4 ml·d-1，于实验的第3，5，7天使用CTX 60 mg·kg-1·d-1，i.p造模；第4组为低剂量组，每鼠用三叶黄合剂5 g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法与第3组同，共10 d；第5组为中剂量组，每鼠用三叶黄合剂10 g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法与第3组同；第6组为高剂量组，每鼠用三叶黄合剂20 g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法与第3组同。给药10 d，末次给药后24 h内检测指标。
       2.2  免疫器官重量测定［2］末次给药后5 h脱颈椎处死小鼠，吸取腹腔液后，解剖小鼠取出胸腺和脾脏，于电子天平上称重。免疫器官系数＝免疫器官重量(mg)∕10 g体重。
       2.3  巨噬细胞活性测定［3］末次给药后5 h脱颈椎处死小鼠，腹腔内注入5 ml冷Hank液，轻揉腹部数分钟后剖腹，无菌吸取腹腔液，装入含肝素的离心管中，2 000 r·min-1离心10 min，吸弃上清液，再用10％NCS-RPMI1640液5 ml重悬，共2次，调整细胞数为5×106个/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100 μl，每个样品做3个复孔，37℃，5%CO2培养箱中孵育4 h使巨噬细胞贴壁。然后用10％NCS-RPMI1640液洗3次，每孔加0.072%中性红100 μl，37℃、5%CO2继续培养4 h。用PBS（pH 7.4）洗3次。每孔加脱色剂（V/V：无水乙醇／冰醋酸1∶1）100 μl，室温放置1 h后振荡混匀，用酶标仪于A530 nm处测OD值。结果以3个复孔的±s表示。
       2.4  血清(IL-2)含量测定末次给药后2 h摘眼球取血，室温下放置1 h，3 000 r·min-1离心10 min分离血清，用125I-IL-2RIA测定血清IL-2含量。有关操作方法按试剂盒说明书进行。
       2.5  NK细胞活性测定(MTT法)［4］末次给药后5 h脱颈椎处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备成脾细胞悬液备用。将脾细胞配成1×106／ml细胞悬液作为效应细胞，取对数生长期的YAC-1细胞配成1×105／ml悬液作为靶细胞，效、靶细胞各取100 μl（效靶细胞的比例为10∶1）至96孔培养板中，每个样品做3个复孔，同时设不加靶细胞的效应细胞对照孔和不加效应细胞的靶细胞对照孔各3孔，置37℃、5 % CO2、相对湿度为100％培养箱中培养4 h，每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），再培养4 h，离心，弃上清，用PBS洗1次以除去效应细胞和被杀伤而脱落下来的靶细胞, 加入30％DMSO 100 μl，振荡后静置20 min, 用酶标仪于波长A570 nm处测OD值, 结果以3个复孔的±s表示NK细胞活性。计算方法为：NK细胞活性（％）= ［1－实验孔OD值－效应细胞孔OD值］/靶细胞孔OD值%×100%。
       2.6  T淋巴细胞增殖反应测定(MTT 法)［5］将上述制备好的脾细胞配制成5×106／ml脾细胞悬液，台朌蓝染色检测细胞存活率＞95％。取脾细胞悬液100 μl 加入96 孔细胞培养板内，每个样品做3个复孔, 加入终浓度为5 μg/ ml的ConA液10 μl（同时设不加ConA的对照孔）, 置37℃、5％CO2、相对湿度为100％的CO2培养箱中培养44 h，加10 μl MTT 溶液（5 mg/ml），继续培养4 h，加入30％DMSO 100 μl，振荡后静置20 min，用酶标仪于波长A570 nm处测OD值，结果以3个复孔的±s表示。
       2.7  统计分析计量数据以±s表示，采用华西医科大学的PEMS 3.1 for Windows统计软件进行t检验，P值表示差异有无显著性。
       3  结果
       3.1  三叶黄合剂对小鼠免疫器官（胸腺、脾脏）重量的影响从表1可见，正常对照组与三叶黄合剂组比较，胸腺指数和脾指数差异均无显著性（P＞0.05）；三叶黄合剂大、中、小3个剂量组均能显著提高CTX免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾指数，与CTX组比较差异有显著性或有高度显著性(P＜0.05或P＜0.01)，表明三叶黄合剂对正常小鼠的免疫功能无明显影响，而对免疫抑制小鼠的免疫功能有显著的提高作用。3个剂量的三叶黄合剂均基本能将免疫抑制小鼠的免疫功能提升到正常水平，除小剂量三叶黄合剂组与正常对照组比较P＜0.05外，大、中剂量三叶黄合剂组与正常对照组比较P＞0.05。表明大、中剂量三叶黄合剂基本上能将受一定剂量CTX免疫抑制小鼠的免疫功能调节至正常水平。从表1还可看到，虽然胸腺指数和脾指数都随剂量的加大而有所提高，但大、中、小3个剂量间比较差异均无显著性（P＞0.05），表明在一定的剂量范围内，三叶黄合剂对小鼠免疫功能的影响随剂量的加大而有所提高，但并无统计学意义。
       表1  三叶黄合剂对小鼠免疫器官(胸腺、脾)重量的影响（略）
       ①第1组与第2，5，6组比较P＞0.05；与第4组比较 P＜0.05；与第3组比较 P＜0.01；②第3组与第4组比较P＜0.05，与其它组比较 P＜0.01；③第4～6组间比较 P＞0.05；④第3组与第4组比较P＞0.05；⑤第3组与其它组比较 P＜0.01
       3.2  三叶黄合剂对小鼠IL-2含量的影响从表2可见，正常对照组与三叶黄合剂组比较，血清IL-2含量差异无显著性（P＞0.05）；三叶黄合剂大、中、小3个剂量组均能显著提高CTX免疫抑制小鼠的血清IL-2含量，与CTX组比较差异有高度显著性(P＜0.01)，表明三叶黄合剂对正常小鼠的血清IL-2含量无明显影响，而对免疫抑制小鼠的血清IL-2含量有显著的提高作用。3个剂量的三叶黄合剂均基本能将免疫抑制小鼠的血清IL-2含量提升到正常水平，除小剂量三叶黄合剂组与正常对照组比较差异有高度显著性外(P＜0.01)，大、中剂量三叶黄合剂组与正常对照组比较差异均无显著性（P＞0.05）。从表2还可看到，血清IL-2含量随三叶黄合剂的剂量增加而提高，呈现出明显的量-效关系。
       表2  三叶黄合剂对小鼠血清IL-2含量的影响（略）
       ①第1组与2，5，6组比较P＞0.05；与第3，4组比较P＜0.01；②第3组与4组比较P＞0.05，与其它组比较P＜0.01；③第4组与第5，6组比较P＜0.01，与第5，6组比较P＞0.05
       3.3  三叶黄合剂对小鼠淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性的影响从表3可见，正常对照组与三叶黄合剂组比较，淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性差异均无显著性（P＞0.05）；三叶黄合剂大、中、小3个剂量组均能显著提高CTX免疫抑制小鼠的淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性，与CTX组比较差异有显著性或有高度显著性(P＜0.05或P＜0.01)，表明三叶黄合剂对正常小鼠的淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性无明显影响，而对免疫抑制小鼠的T淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性有显著的提升作用。3个剂量的三叶黄合剂基本上都能将CTX免疫抑制小鼠的免疫功能提升至正常水平，除小剂量三叶黄合剂组的T淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性与正常对照组比较差异有显著性或高度显著性外(P＜0.01或P＜0.05)，小剂量三叶黄合剂组的巨噬细胞活性及大、中剂量三叶黄合剂组的和NK细胞活性与正常对照组比较均差异无显著性（P＞0.05）。从表3还可看到，淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性随三叶黄合剂剂量的增加而逐步提升，其中小剂量三叶黄合剂组（第4组）的T淋巴细胞增殖反应与中、大剂量组（第5，6组）比较差异有高度显著性外（P＜0.01），而小剂量三叶黄合剂组（第4组）的NK细胞活性与中、大剂量组（第5，6组）比较差异有显著性外（P＜0.05），但大、中剂量（第5，6组）间比较差异均无显著性（P＞0.05），大，中，小3个剂量三叶黄合剂组（第4，5，6组）对巨噬细胞活性比较差异均无显著性（P＞0.05），表明在一定的剂量范围内，三叶黄合剂对小鼠免疫功能的影响虽随剂量的增加而有增高，但增到一定的剂量后，这种增加减缓。
       表3  三叶黄合剂对小鼠T淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性和巨噬细胞活性的影响（略）
       ①第1组与第2，5，6组比较P＞0.05；与第4组比较P＜0.05；与第3组比较P＜0.01；②第3组与第4组比较P＜0.05，与其它组比较P＜0.01；③第4组与6组比较P＜0.05，与第5比较P＞0.05，第5、6组比较P＞0.05；④第1组与第2，5，6组比较P＞0.05；与第3，4组比较P＜0.01；⑤第3组与第4组比较P＜0.05，与其它组比较P＜0.01；⑥第4组与第5，6组比较P＜0.01，第5，6组比较 P＞0.05；⑦第1组与第2，4，5，6组比较P＞0.05；与第3组比较P＜0.01；⑧第3组与第4组比较P＞0.05，与其它组比较P＜0.01；⑨第4～6组间比较P＞0.05
       4  讨论
          
       乙型肝炎病毒（HBV）引起肝炎的发生是由于病毒感染后，体内的细胞免疫在杀伤靶细胞以清除病毒感染的同时，造成了肝细胞损伤而发生肝炎。一般认为HBV感染后出现的肝组织慢性炎症重要原因之一是由于机体细胞免疫功能低下［6］。NK细胞作为非常重要的固有免疫系统成分，在抗病毒感染中发挥着重要的作用，并可通过释放细胞因子起到免疫调节的作用。朱培芳等［7］认为外周血NK细胞数减少与乙型肝炎慢性化有关。机体T淋巴细胞分为两个亚群，即CD4+辅助功能亚群(Th/ TDTH)和CD8+抑制及杀伤功能亚群（Ts/ Tc），具有调节整个机体免疫功能的作用。其数量、比例和功能的改变都可能影响着机体的免疫状态。CD4+ /CD8+细胞的比值是监视人体免疫功能，反映机体免疫状态的重要指标，比值失衡可以导致免疫系统紊乱及一系列免疫病理改变［8］。有资料表明［9］，慢性乙型肝炎患者体内CD4+T细胞数减少，而CD8+ T细胞数升高，由此导致了CD4+ /CD8+比值降低。IL-2既可直接抑制病毒基因的表达和复制，又可激活CTL、NK细胞和B细胞，对体液免疫和细胞免疫均有促进作用［10］。
       
       本实验使用CTX制造免疫功能低下小鼠作为动物模型研究三叶黄合剂对小鼠细胞免疫功能的影响，结果显示三叶黄合剂对正常小鼠细胞免疫无明显影响，但能基本恢复CTX免疫抑制小鼠的细胞免疫。三叶黄合剂对CTX免疫抑制小鼠的胸腺指数、脾指数、血清IL-2含量、单核－巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性和T细胞增殖功能均有不同程度的正向调节作用，能使低下的免疫指标在较短时间内基本恢复到正常水平，提示三叶黄合剂对免疫受抑小鼠有较强的正免疫调节作用，推断，通过增强免疫抑制机体的细胞免疫功能可能是三叶黄合剂治疗乙型肝炎的作用机制之一。三叶黄合剂的作用有一定的剂量依赖关系，三叶黄合剂大、中、小剂量均有较好的免疫调节作用，但在一定的剂量范围内，免疫调节作用随剂量的增加而有增高，当增加到一定的剂量后，这种增加的速度逐步减缓。
       
       虽然我们的研究显示三叶黄合剂对免疫抑制小鼠的细胞免疫有较强的正免疫调节作用，但其具体治疗由乙肝病毒感染引起慢性肝炎的作用机制仍有待进一步研究。
       【参考文献】
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