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       【摘要】 
       目的采用高效液相色谱（HPLC）对山东栽培黄芩药材进行指纹图谱的研究，为黄芩药材质量控制提供实验依据。方法采用kromasil C18，5μm，150 mm×4.6 mm色谱柱，以乙腈0.3%磷酸为流动相进行梯度洗脱，流速1 ml/min，柱温30℃，检测波长280 nm。结果以10个共有峰为评价指标，精密度和重复性实验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，符合有关规定要求。结论该方法操作简单，精密度、稳定性和重复性良好，可作为栽培黄芩药材的质量控制的新方法。
       【关键词】  黄芩 指纹图谱 高效液相色谱法
       色谱指纹图谱分析技术是当前进行复杂物质体系质量控制及研究的重要手段。以中药色谱指纹图谱为代表的一类狭义的化学指纹图谱，着眼于生物代谢产物化学特征的分析与质控模式研究，所形成的理论和技术涉及多个前沿研究领域与交叉学科，有力促进了中药质量控制模式的发展，同时也符合中药现代化发展的必然趋势和要求。因此色谱指纹图谱分析技术目前已逐步成为中药质量评价的关键技术［1］。
       
       黄芩为唇形科植物黄芩Sutellatia baicalensis Georgi.的干燥根。黄芩最早收载于《神农本草经》，为传统常用中药，具有清热燥湿解毒，止血安胎的功效。随着中药野生资源的逐渐减少和自然环境保护的需要，以人工栽培品入药已成为主流，人工种植具有产量大、价格低、环境条件稳定可控等优点，近些年国家也在逐步推行GAP规范化种植基地的建设。黄芩作为山东道地药材目前种植面积非常大，全省种植在6 667 ha以上，且在全国普遍被认为是优质产品，以青岛和文登所产的最著名，有“条芩”“文芩”之称［2］。本文利用HPLC法建立山东栽培黄芩的指纹图谱，利用软件生成对照指纹图谱，为更有效控制栽培黄芩质量，从而为建立符合规模化生产的黄芩基地提供更科学的数据。
       1  仪器与试药
       1.1   仪器与试剂Waters-600高效液相色谱仪，Waters960二极管阵列检测器，Empower工作站;甲醇，乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。
        
       1.2   对照品与样品黄芩苷对照品（批号 110715200514）、黄芩素对照品（批号 111595200604 ）均由中国药品生物制品检定所提供；黄芩药材采集了山东10个不同产地的药材（均由山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定，并按《中国药典》2005年版Ⅰ部“黄芩”项下标准检验，均为合格正品药材），粉碎过20目筛［3］，备用。
       2  方法
       2.1  流动相的选择 流动相采用梯度洗脱，对流动相组成进行考察，采用乙腈0.3％磷酸按不同梯度进行洗脱。色谱柱kromasil C18，5 μm，150 mm×4.6 mm，检测波长280 nm，流速1 ml/min。结果选定以0 min比例13∶87，25min比例为20∶80，45 min比例为30∶70，55 min比例为40∶60，65 min回到原始比例的梯度洗脱，分离效果最好。
       2.2  检测波长的选择 《中国药典》明确黄芩苷在280 nm处有最大吸收，因此选择250，260，270，280，290，300，310，320 nm波长进行考察。最后结果显示在280nm波长下各特征峰吸收度差别较小，整个图谱中各峰之间的比例较协调，直观效果较好，提供信息量较大。
       2.3  流速和柱温的考察 取同一批样品，按上述测定方法，对流速0.8 ml/min，1.0 ml/min，1.2 ml/min分别进行考察。结果表明，不同流速，除了保留时间有所改变外，峰形及分离情况均不受影响，按常规，选择流速1.0 ml/min。柱温选择30，35，40℃进行考察。结果表明，30℃柱温时色谱峰分离最好。
       2.4   样品提取溶剂的选择取同一批样品，精密称取0.1 g 3份，分别加醋酸乙酯－甲醇（3∶1），氯仿甲醇（1∶1），70%乙醇各20 ml，加热回流2 h，放冷，滤过，滤液蒸干，用色谱甲醇转移并定容至10 ml容量瓶，过0.45 μm的滤膜，即得供试品溶液。测得指纹图谱。结果显示，用醋酸乙酯甲醇（3∶1）作溶剂时图谱信息量最大且各峰比例协调。
       2.5  参照峰的选择用上述色谱条件，分别注入液相色谱仪黄芩苷和黄芩素对照品溶液10 μl，进行测定。结果黄芩素在整个色谱图的最后位置出峰，而黄芩苷出峰时间适中且分离良好，因此选择黄芩苷作为参照物［4］。
        
       2.6  评价系统  采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统试用版(2004A) 。
        
       2.7  供试溶液的制备
       2.7.1  对照品溶液的制备分别精密称定黄芩苷对照品和黄芩素对照品适量，加色谱甲醇溶解并稀释成60 μg/ml和0.1 mg/ml的溶液。
       2.7.2  供试品溶液的制备   取黄芩药材中粉0.1g，精密称定，加醋酸乙酯－甲醇（3:1）20 ml，加热回流2 h，放冷，滤过，并用少量提取溶剂洗涤容器和残渣，滤液蒸干，用色谱甲醇溶解并移至10  ml容量瓶中定容，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。
       2.8  方法学考察
       2.8.1  精密度  取黄芩样品一批，制备供试品溶液。按上述方法重复进样6次，考察精密度。考察10个主要色谱峰的相对保留时间的RSD为0.028 9%～1.073 4%，峰面积大于5％的共有峰峰面积的RSD为0.281 6%～2.955 5%，均符合规定。将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算整体相似度为0.999～1，表明仪器精密度良好。
        
       2.8.2  重复性取同一批黄芩样品5份，制备供试品溶液，测定指纹图谱。考察10个主要色谱峰的相对保留时间的RSD为0.1306％～2.279 9％，峰面积大于5％的共有峰峰面积的RSD为1.315 9％～2.777 7％，均符合规定。将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算整体相似度为0.999～1，表明该方法重复性良好。 
        
       2.8.3  稳定性取黄芩样品适量，制备供试品溶液，分别在0，3，6，12，24 h进样，测定指纹图谱。考察10个主要色谱峰的相对保留时间的RSD为0.036 5％～0.560 0％，峰面积大于5％的共有峰峰面积的RSD为1.556 2％～2.245 3％，均符合规定。将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算整体相似度为0.999～1，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
        
       2.9  黄芩药材指纹图谱的建立
        
       2.9.1  图谱测定时间的确定取样品溶液 10μl ，注入高效液相色谱仪 ，记录120 min 内色谱图 ，结果表明 ，65 min 后无有意义峰出现 ，故确定图谱记录时间为65 min。
        
       2.9.2  指纹图谱共有峰的标定 对10个产地的黄芩样品进行了测定，将10批样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，利用手动多点校正，对色谱峰进行匹配，选定稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰，共标定了10个特征峰（占总峰面积的90％以上），各峰的相对保留时间的RSD在0.218 6%～1.476 5%之间。见表1。
       表1   共有峰的保留时间（略）
       2.9.3  相似度分析对10批黄芩样品进行测定，进样量10 μl，获得各被测样品的指纹图谱。对10批样品的测定结果以AIA的数据格式导出，输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以中位数作为模板，计算各样品的整体相似度，各样品的整体相似度在0.835～0.997之间。见图1和表2。
       
       由表2可看出各批样品相似度除了S6泰安农大的小于0.9外，其余样品相似度均大于0.94，各样品间相似度良好。
       图1   相似度测定结果（略）
        
       2.9.4  系统聚类分析用SPSS11.0软件，以各批样品指纹图谱相对峰面积为变量，采用中位数法，以欧式平方距离对样本聚类分析，结果见图2。
       由图2可以看出样品6区别于其余样品，自为一类，这与相似度分析的结果基本一致。
        
       2.9.5  对照指纹图谱的建立及评价根据10批样品指纹图谱的特点，确定10个共有指纹峰，标号见图1。导出各批指纹图谱的信号，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算生成对照指纹图谱，见图3及表3。并计算各批次黄芩药材的供试液指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似度。结果见表4。结果10批次的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度除S6 泰安农大的样品外均大于0.95。
       图2   聚类分析表（略）
       表2   相似度结果（略）
       图3  黄芩对照指纹图谱（略）
       表3  各共有峰技术参数（略）
       表4  10批栽培黄芩与对照指纹图谱相似度（略）
       3  讨论
       
       　　本实验采用的HPLC法对山东10批不同产地的黄芩进行分析，发现各指纹图谱虽存在一定差异，但均具有相同色谱特征峰，且各色谱峰分离分析效率高，保留时间也相当稳定，由此建立的对照指纹图谱可作为山东栽培黄芩质量综合控制的新方法。
       
       样品6 与对照图谱差别大的原因在于黄芩素的峰吸收值太大，根据了解可能是因为样品处理时，没有及时晒干，使部分黄芩苷分解成黄芩素（苷元）所致。
       【参考文献】
         　　［1］ 田润涛，谢培山.色谱指纹图谱相似度评价方法的规范化研究（一）［J］.中药新药与临床药理，2006，17(1):113.
       
       ［2］ 余椿生.黄芩［J］.食品与药品，2006，8(4):67.
       
       ［3］ 国家药典委员会.中国药典［S］.北京:化学工业出版社，2005:211.
       
       ［4］ 洪筱坤，王智华.中药数字化色谱指纹谱［M］.上海:上海科学技术出版社，1996:70.