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       【摘要】 
       目的测定肾气丸各拆方组水煎液中乌头碱、次乌头碱的含量，分析肾气丸“阴中求阳”配伍对方中乌头碱、次乌头碱含量的影响。方法将肾气丸组方药物拆方分为补阳组-1、补阳组-2、补阴组-1、补阴组-2、阴阳双补组-1和阴阳双补组-2（即肾气丸全方），采用高效液相色谱法测定肾气丸各拆方组水煎液中乌头碱、次乌头碱的含量。结果各组水煎液中均未检测出乌头碱含量，阴阳双补组-2、阴阳双补组-1中次乌头碱含量均低于补阳组-1、补阳组-2，阴阳双补组-2中次乌头碱含量低于阴阳双补组-1，且都具有统计学意义。 结论肾气丸“阴中求阳”配伍能减小水煎液中次乌头碱的含量从而有降低毒性的作用。
       【关键词】  肾气丸 阴中求阳 乌头碱 次乌头碱 高效液相色谱法
       Influence of Compatibility of Shenqi-Pill “Reinforcing Yang from Yin” on the Content of Aconitine and Hypaconitine in the Decoction
       FAN Mingwei，CHEN Weixuan，ZHUO Lianjia，LI Zhengmu*，WU Yong
       （Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）
       Abstract：ObjectiveTo detect the content of aconitine and hypaconitine in decoction of each dismantled Shenqi-Pill drug group, and analyze the influence of compatibility of Shenqi-Pill "reinforcing Yang from Yin" on the content of aconitine and hypaconitine in each decoction.MethodsDivided the drugs of Shenqi-Pill into Invigorating Yang Group Ⅰ, Invigorating Yang Group Ⅱ, Invigorating Yin Group Ⅰ, Invigorating Yin Group Ⅱ, Invigorating Yin-Yang Group Ⅰ, Invigorating Yin-Yang Group Ⅱ（the whole Shenqi-Pill）. And to measure the content of aconitine and hypaconitine in each dismantled Shenqi- Pill drug decoction by using the method of high performance liquid chromatogram.ResultsThe content of aconitine can not be detected in each group. The contents of hypaconitine in Invigorating Yin-Yang Group Ⅱ and Invigorating Yin-Yang Group Ⅰ are both lower than those in Invigorating Yang Group Ⅰ and Invigorating Yang Group Ⅱ. Meanwhile, the content of hypaconitine in Invigorating Yin-Yang Group Ⅱ is also lower than that in Invigorating Yin-Yang Group Ⅰ. All of these possess statistical significance. ConclusionThe content of hypaconitine in the decoction can be lowered through compatibility of Shen-qi Pill “reinforcing Yang from Yin” and the toxicity is minished.
       Key words：Shenqi-Pill;  Reinforcing Yang from Yin;  Aconitine;  Hypaconitine;  High performance liquid chromatogram
       
       肾气丸出自东汉张仲景的《金匮要略》，由附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、丹皮、泽泻、茯苓等8味药物组成，具有补肾助阳的功效，是治疗肾阳虚证的有效经方。本方在大量滋阴补肾药物之中加入少量的附子、桂枝以达到微微生火、少火生气的目的，体现了“阴中求阳”的配伍思想，是方剂配伍理论中值得探讨研究的课题。本研究通过将肾气丸组方药物进行拆分，测定各个拆方组水煎液中乌头碱、次乌头碱的含量，并比较其含量变化。现报道如下。
       1    仪器与试剂
       1.1   仪器DIONEX P680高效液相色谱仪；UVD170U型紫外可见光检测器；Chromeleon工作站；分析天平；超声清洗仪。
       1.2  试剂甲醇（色谱纯，美国Dikma公司），无水乙醇，乙醚（分析纯），浓氨水，pH试纸。
       1.3   对照品乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110720-200410），次乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110798-200404）。
       1.4  药材附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓，均由广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授鉴定为正品。
       2    方法与结果
       2.1    拆方分组  将肾气丸组方药物分为补阳组-1：附子、桂枝；补阳组-2：附子、桂枝、丹皮、泽泻、茯苓；补阴组-1：干地黄、山茱萸、山药；补阴组-2：干地黄、山茱萸、山药、丹皮、泽泻、茯苓；阴阳双补组-1：附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药；阴阳双补组-2：即肾气丸全方。其中含有附子的组有：补阳组-1，补阳组-2，阴阳双补组-1，阴阳双补组-2。
       2.2   高效液相色谱条件  色谱柱Platisil (铂金) ODS（5 μm，250 mm×4.6mm）；柱温为室温；流动相为甲醇-水-三乙胺（80∶20∶0.1），流速1 ml/min；检测波长235 nm；进样量20 μl。
       2.3  对照品溶液的制备分别精密称取乌头碱对照品2.19 mg、次乌头碱对照品2.98 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得每毫升含乌头碱219 μg、次乌头碱298 μg的混合溶液，作为对照品溶液。
       2.4  供试品溶液的制备称取含附子3 g（以附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓1∶1∶8∶4∶4∶3∶3∶3的比例计算）的各拆方组药材，以适量水浸泡30 min，煎煮60 min左右，得药液约20 ml，浓氨水调节pH值至10左右，用乙醚萃取3次（20 ml/次），合并乙醚液，室温挥干，残渣用甲醇溶解并定容至2 ml，0.45 μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
       2.5   标准曲线及线性范围精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，置2 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得系列标准溶液。取上述标准溶液，按文中报道的色谱条件分别进样20 μl测定，以进样浓度（μg/ml）为横坐标（C），峰面积（mAU）为纵坐标（A）进行线性回归，得乌头碱的回归方程A = 0.370 2C - 0.714 9，r = 0.999 8；次乌头碱的回归方程A = 0.389 1C -0.607 8，r = 0.999 8，结果表明：乌头碱在10.95 ～ 65.70 μg/ml，次乌头碱在14.90 ～ 89.40 μg/ml范围内线性关系良好，符合外标定量法测定要求。
       2.6  精密度实验用混合对照品溶液进样20 μl，连续测定6次，根据所得峰面积计算，乌头碱RSD = 1.71%，次乌头碱RSD = 1.75%，表明精密度良好。
       2.7    阴性对照实验 肾气丸全方按照含附子3克的比例称取不含附子的其他药，按照上述供试品制备方法，制成缺附子阴性对照溶液，用与样品相同的色谱条件测定，在与样品相同保留时间处无干扰峰。结果见图1～3。
       图1  乌头碱、次乌头碱对照品HPLC色谱图（略）
       图2  肾气丸全方HPLC色谱图（略）
       图3  缺附子阴性对照色谱图（略）
       2.8  样品测定按照含量测定方法测定各拆方组的样品，记录峰面积，计算乌头碱、次乌头碱在各拆方组中的含量（以单克附子计算），用SPSS统计软件进行分析。结果见表1，色谱图见图4～7。
       表1  样品含量测定结果（略）
       与补阳组-1比较，** P<0.01；与补阳组-2比较，△△P＜0.01；与阴阳双补组-1比较，▲▲P＜0.01
       
       各组水煎液中均未能检测出乌头碱的含量。阴阳双补组-2、阴阳双补组-1水煎液中次乌头碱含量均低于补阳组-1、补阳组-2，阴阳双补组-2中次乌头碱含量低于阴阳双补组-1，且都具有统计学意义。
       图4  补阳组-1色谱图（略）
       图5  补阳组-2色谱图（略）
       图6  阴阳双补组-1色谱图（略）
       图7  阴阳双补组-2（肾气丸全方）色谱图（略）
       3  讨论
          
       本研究在实验过程中比较了甲醇-水-三氯甲烷-三乙胺（70∶30∶2∶0.1）［1］、甲醇-水-三乙胺（75∶25∶0.1）、甲醇-水-三乙胺（80∶20∶0.1）3种流动相，前两种流动相目标成分出峰时间较长，而甲醇-水-三乙胺（80∶20∶0.1）出峰时间较短且分离完全，各拆方组中次乌头碱的理论塔板数均大于10 000；而检测波长比较了230，235，240 nm 3个波长，以235 nm检测波长峰形最好。
       
       《金匮要略》所载肾气丸的用法是作丸剂服用，但现代用法亦可作汤剂，故本研究选择对肾气丸水煎液中的成分进行实验测定。
       
       传统中药理论认为附子性大热，有毒［2］。现代药理研究表明，附子含有多种生物碱，其中以乌头碱、次乌头碱、中乌头碱等为主［3］。生物碱为附子的药理活性物质，同时也是毒性成分，其中尤其以二萜双酯型生物碱（乌头碱、次乌头碱、中乌头碱）毒性最强，其中人口服乌头碱0.2 mg即可发生中毒反应，3～5 mg可引起死亡，肌注0.2～0.3 mg可致死［4］。经过炮制或煎煮后，双酯型乌头碱会水解成乌头次碱、乌头原碱从而大大降低毒性。有研究报道，经过炮制，生川乌、生附片中3种双酯型生物碱的含量大幅下降，其中乌头碱下降幅度最大，而次乌头碱、中乌头碱的下降幅度较小［5］。
       
       实验结果各组药物中均未能检测出乌头碱的含量，另用3g附子按供试品溶液的制备方法处理后进行测定，也未能检测出乌头碱而只检测到次乌头碱。分析其原因，可能为：①本实验所购买的附子为经过炮制的熟附片，经过炮制处理后，其中的主要毒性成分乌头碱含量已大大降低；②在煎煮过程中，附子中可能存在的少量乌头碱发生水解反应，因此在实验中无法检测出乌头碱的含量。
       
       次乌头碱的测定结果表明，阴阳双补组-2（即肾气丸全方）、阴阳双补组-1（附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药）水煎液中次乌头碱的含量明显低于未配伍补阴药（干地黄、山茱萸、山药）的补阳组-1（附子、桂枝）和补阳组-2（附子、桂枝、丹皮、泽泻、茯苓），而配伍了“三泻”（丹皮、泽泻、茯苓）的阴阳双补组-2中次乌头碱的含量也比阴阳双补组-1有所降低。实验结果提示，配伍了补阴药物后，可能是由于促进了次乌头碱的水解反应或者抑制了次乌头碱在水中的溶解，从而减小其在水煎液中的含量，有降低毒性的作用。而配伍"三泻"药物后，有增强此作用的趋势。
       
       综上所述，肾气丸的"阴中求阳"配伍，在大量滋阴泻火药中少佐温阳药以达微微生火、少火生气的同时，还能够减少附子中毒性成分次乌头碱在水煎液中的含量，起到降低毒性的作用。
       【参考文献】
         　　［1］ 郑杭生,冯年平.中药饮片制川乌、制草乌中乌头碱、次乌头碱的HPLC测定［J］.药物分析杂志,2005,25(1):35.
       
       ［2］ 黄兆胜.中药学［M］.北京:人民卫生出版社,2004:225.
       
       ［3］ 沈映君.中医药学高级丛书.中药药理学［M］.北京:人民卫生出版社,2000:490.
       
       ［4］ 李娅萍,田颂九,王国荣.乌头类药物的化学成分及分析方法概况［J］.中国中药杂志,2001,26(10):660.
       
       ［5］ 彭 波,杨华元,刘世瑞.反相离子对色谱法分离测定川乌和附片中乌头类生物碱的方法研究［J］.药物分析杂志,1995,15(6):13.