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       【摘要】 
       目的探讨藤茶总黄酮的体外抗肿瘤作用。方法采用MTT法、生长曲线法、细胞集落形成法观察藤茶总黄酮对人胃癌SGC-7901细胞抑制作用。结果藤茶总黄酮能明显抑制体外培养的SGC-7901细胞的生长，MTT法IC50为20.71μg·ml-1；细胞生长曲线法提示其对SGC-7901细胞的生长也有明显的抑制作用；集落形成法，当药物浓度在9.90μg·ml-1以上时抑制率为100%，当药物浓度为6.60μg·ml-1时抑制率为69.80%，当药物浓度为4.40μg·ml-1时抑制率为30.23%。结论藤茶总黄酮对体外SGC-7901细胞的生长有明显的抑制作用。
       【关键词】  藤茶总黄酮 抗肿瘤作用 SGC-7901 细胞株
       Inhibitory Effects of Vine Tea Extract on Proliferation of SGC-7901 Human Stomach Cancer Cells
       ZHENG Zuowen,GUO Chengxian, MAO Jian,TAN Wei
       （Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning 530001，China; Graduate Student of 2006 Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning 530001，China）
       Abstract：Objective To investigate the anti-tumor effect of Vine tea extract in vitro.MethodsThe growth inhibition was analyzed by MTT, cell colony and cell growth curve measurement in the stomach cancer cell SGC-7901.ResultsVine tea extract could obviously inhibit the growth of cultured SGC-7901 cells, the IC50 in MTT assay was 20.71 μg·ml-1; Vine tea extract could obviously affect the tumor cell growth.The inhibitory  ratio in cell colony assay was 100 % when medicine density was over 9.90 μg·ml-1, the repressive ratio in cell colony assay was 69.80 % when medicine density was 6.60 μg·ml-1 ;the repressive ratio in cell colony assay was 30.23 % when medicine density was 4.40 μg·ml-1. ConclusionVine tea extract can inhibit the growth of SGC-7901 in vitro.
       Key words：Vine tea extract;  Anti-tumor effect;  SGC-7901；  Cell line
       
       藤茶Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄的嫩茎叶［1］。藤茶中含有大量黄酮类有效成分，用分光光度法对藤茶所含黄酮成分进行含量测定，以蛇葡萄素为指标，藤茶中总黄酮的含量高达45.52%［2］。多项药理学研究表明，藤茶具有调节血糖和血脂、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用［3～7］，其中抗肿瘤作用是近年来研究的热点。本研究对从藤茶提取分离得到的粉状淡黄色结晶进行抗人胃癌SGC-7901细胞研究，以进一步揭示藤茶总黄酮的抗肿瘤作用。
       1  材料与仪器
       1.1   药物 藤茶总黄酮由广西中医学院中药化学教研室通过柱层折提取分离，为一粉状淡黄色结晶，为黄酮类化合物，经含测，纯度为91.1%。
       1.2  细胞 人胃癌细胞SGC-7901，由广西中医学院分子生物学实验中心惠赠。
       1.3  试剂 RPMI-1640干粉(美国Gibco公司产品)；新生牛血清（杭州四季青公司产品，批号031101）；四甲基二氮唑蓝（北京拜尔迪生物公司分装，Amresco 0793）；二甲基亚砜（博大泰克公司产品）；0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone Lab公司产品)；注射用生理盐水(徐州莱恩药业公司产品，批号051122)。
       1.4  仪器 SUNRISE自动酶标仪(奥地利TECAN公司产品)；311二氧化碳培养箱(美国ThermoForma公司产品)；DLF560型超净工作台(荷兰clear Air Techniek bv公司产品)；细胞培养瓶(加拿大 BIOFIL公司产品)；96孔板(上海Sunub科技发展公司产品)；倒置显微镜(广西梧州光学仪器厂产品)；微量移液器(法国Pipetman公司产品)；十万分之一电子天平(德国赛多利斯产品)。
       1.5   培养液及试剂的配制 RPMI-1640不完全培养液，不加血清的RPMI-1640培养液;RPMI-1640完全培养液，10%新生牛血清＋RPMI-1640不完全培养液。
       2  方法与结果
       2.1   SGC-7901细胞培养 在长满SGC-7901细胞的培养瓶内加0.25%胰酶，37℃消化3～4 min，加培养液吹打，1∶3传代，3～5 d长满。消化后计数，配制成10×104/ml细胞悬液，置37℃，5%CO2培养箱中培养备用。
       2.2   MTT法测定［8，9］将SGC-7901细胞（1×105/ml）接种到96孔细胞培养板上，每孔190 μl，并设空白对照组（只加RPMI1640完全培养液,不加细胞）。藤茶总黄酮8个剂量组分别加入不同浓度的藤茶总黄酮10 μl/孔（终浓度分别为75.00，50.00，33.37，22.26，14.84，9.90，6.60，4.40 μg·ml-1），每个浓度均设4个复孔，同时设细胞对照孔（只加细胞和RPMI1640完全培养液，不加药物）。在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h，加入MTT（5 mg·ml-1）10 μl继续培养4 h，弃上清，用RPMI-1640不完全培养液洗板2次，加入DMSO150 μl，振荡10 min,以酶标仪在550 nm处测各孔吸光度值（OD），计算抑制率，用对数回归方程求出半数杀伤浓度（IC50）。肿瘤细胞生长抑制率按下式计算。
       
       肿瘤细胞生长抑制率（%）＝（1－实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%
       2.3  生长曲线法测定［8，9］取对数生长期的细胞，用10%新生牛血清的RPMI1640培养液配成1×104 /ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔190 μl，空白对照组每孔加入10 μl的RPMI-1640完全培养液。藤茶总黄酮5个剂量组分别加入终浓度分别为22.26，14.84，9.90，6.60，4.40 μg·ml-1的藤茶总黄酮，10μl/孔，每个浓度均设4个复孔，对照组加入等体积的细胞培养液，置37℃，5%CO2 培养箱中培养，分别于用药后第0，1，2，3，4天用台盼蓝拒染法进行活细胞计数。以每毫升活细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线图。
       2.4   集落形成法［8，9］取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰酶溶液消化并吹打成单个细胞悬液，把细胞悬浮在含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中备用。将悬浮细胞作适当稀释，接种于24孔板中，每孔加入1 ml浓度为50个/ml的细胞，并作十字摇动，混匀。空白对照组每孔加入10μl的RPMI-1640完全培养液。藤茶总黄酮4个剂量组分别加入不同浓度的藤茶总黄酮1 ml/孔（终浓度为14.84，9.90，6.60，4.40 μg·ml-1），每个浓度均设3个复孔，对照组加入等体积的溶剂。混匀后将24孔板移入CO2箱，在37℃，5%CO2及饱和湿度环境下，静止培养7 d。弃去培养液，用姬姆萨应用液染染色，在镜下计数大于50个细胞的克隆数。
       
       抑制率（%）=（1-实验组克隆数/对照组克隆数）×100%
       3  结果
       3.1  MTT法用MTT法观察不同浓度的藤茶总黄酮对体外培养的SGC-7901细胞的影响，结果如表1所示。当药物终浓度为75.00，50.00，33.37，22.26，14.84，9.90 μg·ml-1时，抑瘤率与细胞对照组相比差异有非常显著性（P<0.01）；当藤茶总黄酮终浓度为6.60 μg·ml-1时，抑瘤率与细胞对照组相比差异有显著性（P<0.05），提示其有较强的体外抑制SGC-7901细胞作用。通过抑瘤率对药物浓度作对数回归方程，得到药物对SGC-7901细胞的半数杀伤浓度（IC50）为20.71 μg·ml-1，r=99%。结果见表1。
       表1  MTT法藤茶总黄酮对SGC-7901细胞的抑制作用（略）
       与空白对照组比较，** P<0.01，* P<0.05；n=4
       3.2  生长曲线法采用生长曲线法观察不同浓度的藤茶总黄酮对体培养的SGC-7901细胞的影响，结果如表2所示，藤茶总黄酮对体外培养的SGC-7901细胞的增值表现出较强的抑制作用，且成剂量-效应关系。
       
       表2  生长曲线法藤茶总黄酮对SGC-7901细胞的抑制作用（略）
       与空白对照组比较，** P<0.01，* P<0.05；n=4
       3.3  集落形成法用集落形成法观察不同浓度的藤茶总黄酮对体外培养的SGC-7901细胞的影响，结果如表3所示，当藤茶总黄酮终浓度为14.84，9.90 μg·ml-1时，抑制率为100%；当藤茶总黄酮终浓度为6.60μg·ml-1时，抑制率为69.8%，与细胞对照组相比差异有显著性（P<0.05）；当藤茶总黄酮终浓度4.40 μg·ml-1时，抑瘤率为30.23%，提示其有较强的体外抑制SGC-7901细胞作用。
       表3  集落形成法藤茶总黄酮对SGC-7901细胞的抑制作用（略）
       与空白对照组比较，** P<0.01，* P<0.05；n=4
       4  讨论
          
       恶性肿瘤是世界医学的一大难题，严重威胁着人类的健康。由于传统的抗肿瘤治疗，手术、放疗、化疗，毒副作用大、患者生存质量低，人们开始从中草药中寻找新的抗肿瘤药。我国是一个中草药资源丰富的大国，从我国传统医药中筛选新的抗肿瘤药物，日益受到国内外学者的重视。黄酮类化合物是一类存在于多种植物中的多酚化合物，具有多种药理作用，其中抗肿瘤作用是近年来研究的一个热点。本文采用3种体外抗肿瘤实验方法——MTT法、生长曲线法、集落形成法，均证实藤茶总黄酮对人胃癌SGC-7901细胞有明显的抑制作用，且呈现出一定的剂量依赖趋势。本实验研究提示藤茶总黄酮的抗肿瘤作用部位不在线粒体，因为MTT法只适用于作用部位不在线粒体的药物；从生长曲线法可以看出藤茶总黄酮在作用48 h时对SGC-7901抑制作用最强；同时由集落形成法可以知道藤茶总黄酮对肿瘤干细胞有较强的抑制作用。
       【参考文献】
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