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       【摘要】 
       目的观察田基黄不同提取物的含药血清体外抗乙肝和抗肝癌的作用。方法采用酶链免疫法，观察田基黄不同提取物的含药血清对2215细胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用。采用MTT技术，观察田基黄不同提取物的含药血清对肝癌细胞BEL-7404增殖的抑制作用。结果当含药血清浓度为5％时，田基黄乙醇总提取物和正丁醇提取物对HBeAg和HBsAg呈现较好抑制作用，抑制率分别为34.84％和57.95％，以及76.02％和53.15％（P＜0.05）；当含药血清浓度为20％时，醋酸乙酯提取物对HBeAg和HBsAg呈现较好的抑制作用，抑制率分别为79.79％和57.22％（P＜0.05）；水提取物3种浓度的含药血清对HBeAg和HBsAg都有较好的抑制作用，抑制率分别达到了70％和30％以上（P＜0.05）。田基黄各提取物对肝癌BEL-7404细胞都有一定的抑制作用，该抑制作用呈明显的量效关系，当含药血清浓度为20％时，乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的抑制率分别为29.74％，53.80％，40.79％和54.24％（P＜0.01）。结论 田基黄不同提取物含药血清能抑制2215细胞分泌HBeAg和HBsAg，并且能抑制肝癌细胞BEL-7404的增殖。其抗乙肝的有效成分主要分布在田基黄的水提取物中，而抗肝癌的有效成分则均衡分布于各种极性部位。
       【关键词】  田基黄 2215细胞 BEL-7404细胞 血清药理学
       Experimental Study on Anti- hepatitis B and Anti-hepatoma Effect of Different Extracts in Serum of Hypericum japonicum Thunb. in Vitro
       PAN Xiaojiao,YANG Ke, ZENG Jinqiang,WEI Zhiying, CHEN Chen
       (Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning, Guangxi 530001，China;Guangxi Frontier Forces Hospital, Nanning,Guangxi 530022,China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the anti- hepatitis B and anti-hepatoma effect of different extracts in serums of Hypericum japonicum Thunb. in vitro. MethodsEnzyme linked immune response was used to investigate the effect of the different extracts in serums of Hypericum japonicum Thunb. on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cell in vitro.MTT technique was used to investigate the effect of the different extracts in serums of Hypericum japonicum Thunb. on the growth of hepatoma BEL-7404 cell in vitro. ResultsEtOH and BuOH extracts showed better inhibitory rates on HBeAg and HBsAg as 34.84％，57.95％ and 76.02％，53.15％（P＜0.05）in 5% serum respectively. EtOAc extracts showed better inhibitory rates on HBeAg and HBsAg as 79.79％ and 57.22％（P＜0.05）in 20% serum respectively. H2O extracts had stable inhibitory rates on HBeAg and HBsAg in the three different concentration of serum and the inhibitory rates were all more than 70% and 30% respectively. All extracts showed the inhibitory activity on the growth of hepatoma BEL-7404 cell in vitro and there was obvious dose-effect relationship. The inhibitory rates of EtOH，EtOAc，BuOH and H2O extracts in 20% serum were 29.74％，53.80％，40.79％ and 54.24％,respectively(P＜0.01).ConclusionThe different extracts of Hypericum japonicum Thunb. in serum have the inhibitory effect on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cell and on the growth of hepatoma BEL-7404 cell in vitro. The stable active compounds of anti- Hepatitis B mainly distribute in H2O extracts and the active compounds of anti-hepatoma evenly distribute in each extracts.
       Key words：Hypericum japonicum Thumb.;   2215 Cell;   BEL-7404 Cell;   Seropharmacology
       
       田基黄原名地耳草，始载于《生草药性备要》《植物名实图考》，别名雀舌草，系藤黄科金丝桃属植物地耳草Hypericum japonicum Thumb.的干燥全草。味甘、微苦，性凉，归肝、胆、大肠经。具有清热利湿、散瘀止痛、消肿解毒的功效［1］。现已研究发现田基黄中含有内酯、香豆素、酚类、蒽醌、黄酮类、维生素类等化学成分［1～4］。现代药理研究表明，田基黄具有明确的保肝、抑制癌细胞药理学功效；临床用于治疗急、慢性肝炎，传染性肝炎，原发性肝癌，伤寒，副伤寒等。但是直至目前，田基黄的抗乙肝和肝癌有效成分或有效部位仍然不够清晰。本实验研究旨在阐明田基黄的抗乙肝和肝癌有效部位，为进一步确定其有效化学成分奠定基础。
       1  材料
       1.1  药物  田基黄经广西中医学院药用植物教研室韦松基副教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物地耳草Hypericum japonicum Thumb.的干燥全草。
       1.2  动物  昆明种小鼠，体重22～26 g，雌雄兼用，由广西中医学院实验动物中心提供，合格证号：桂医动字第11004号。
       1.3  试剂  Eagles MEM干粉、RPMI-1640培养基（美国Gibco公司产品，批号：1041001，批号：1243098）；G418、L-谷氨酰胺（北科化学试剂公司进口分装）；新生牛血清(NBS，杭州四季青公司，批号：060720)；卡那霉素、青霉素、链霉素（Sigma分装）；二甲基亚砜（DMSO，上海生物工程有限公司，批号：54186）；HBsAg，HBeAg检测试剂盒（上海荣盛生物科技有限公司，批号：20070605，20070711）；MTT (北京拜尔迪生物公司分装，Amresco0793)。
       1.4  细胞系及培养液  HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的2215细胞（购自中国医学科学院中国医药生物技术研究所）： 2215细胞用MEM培养液培养，培养液含10%胎牛血清，0.03%谷氨酰胺，G418 380μg·ml-1，卡那霉素50 U·ml-1，pH7.2。细胞消化液含0.25%胰蛋白酶，用D-Hangs配制。
       
       肝癌BEL-7404细胞(广西民族医院惠赠)：肝癌BEL-7404细胞用RPMI-1640培养液培养，培养液含10%胎牛血清、青霉素100 U·ml-1，链霉素100 U·ml-1。细胞消化液含0.25%胰蛋白酶，用D-Hangs配制。
       1.5  器材  培养瓶（丹麦Tunclon公司产品）；96孔细胞培养板（美国Corning公司产品）；二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；倒置显微镜(德国Leica公司)；酶标仪(奥地利Sunrise公司)；吉尔森微量移液器(法国Pipetman公司)；BDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。
       2  方法与结果
       2.1  田基黄不同提取物的制备  取田基黄95％乙醇提取干浸膏37.6 g（每克干浸膏相当于9.1 g生药），溶于300 ml水中，用醋酸乙酯萃取5次，300 ml/次；水层再用正丁醇萃取5次，300 ml/次。分别合并水层，正丁醇层和醋酸乙酯层，减压回收溶剂，备用。另取37.6 g田基黄干浸膏，和上述各层提取物，分别溶于适量水中，最后定容成100 ml，4℃保存备用。
       2.2  含药血清的制备［5］  取小鼠40只, 体重22～26 g，雌雄兼用。分为5组：空白血清组(灌胃给予生理盐水)，田基黄乙醇总提取物血清组，田基黄醋酸乙酯提取物血清组，田基黄正丁醇提取物血清组，田基黄水提取物血清组。含药血清组按每次20 ml·kg -1（68.4 g生药/kg）剂量灌胃给药，每天给药两次（每天的总给药量约为田基黄半数致死量的50%），连续3 d，末次给药后1 h，摘眼球取血，离心分离血清，56℃灭活30 min。分别用不含血清的MEM培养液和RPMI-1640培养液稀释成40%，20％和10％的血清浓度，分别过滤，4℃保存备用。
       2.3  细胞培养
       2.3.1  2215细胞培养在长满2215细胞培养瓶内用0.25%胰酶，37℃消化3～4 min，加培养液吹散，1∶3传代；10 d长满。消化后计数，配制成1×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100μl，在37℃，5％的CO2培养箱中培养24 h，细胞长成单层后进行实验。将含各浓度血清的MEM培养液加入到96孔板中，每种血清每浓度平行3孔，每孔100μl，使含药血清最终浓度分别为20％、10％和5％。同时设无药物细胞对照组和培养液空白对照组各3孔。收集第4天细胞培养上清液，在450 nm波长处用酶标仪测OD值。应用SPSS14.0统计软件进行组间ｔ检验，并按以下公式计算抑制率。结果见表1。
       
       抑制百分率(%)＝无血清细胞对照组OD值均数－田基黄提取物血清组OD值均数无血清细胞对照组OD值均数－培养液空白对照组OD值均数×100％
       2.3.2  肝癌BEL-7404细胞的培养将培养瓶中的7404细胞株用0.25%胰蛋白酶、0.2% EDTA消化后，加入RPMI-1640培养液，将细胞配制成5×104个/ml的细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔100μl，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长后(约15 h)，每孔分别加入含不同浓度血清的RPMI-1640培养液，每种血清每浓度平行6孔，每孔100μl，使含药血清最终浓度分别为20％，10％和5％。每个96孔培养板中设无血清细胞对照组各6孔。继续培养48 h，然后加入0.5％MTT溶液，10μl/孔，继续培养4h。2000 r·min-1离心15 min，弃去上清液；每孔加入200μl DMSO，轻振10 min后在490 nm波长处用酶标仪测OD值。应用SPSS14.0统计软件进行组间ｔ检验，并按以下公式计算抑制率。结果见表2。
       
       抑制率（%）＝空白血清组OD值均数－田基黄提取物血清组OD值均数空白血清组OD值均数×100%
       
       对2215细胞分泌HBeAg和HBsAg的影响实验结果显示：当含药血清浓度为5％时，田基黄乙醇总提取物和正丁醇提取物对HBeAg和HBsAg呈现较好抑制作用，抑制率分别为34.84％和57.95％，以及76.02％和53.15％（P＜0.05）；当含药血清浓度为20％时，醋酸乙酯提取物对HBeAg和HBsAg呈现较好的抑制作用，抑制率分别为79.79％和57.22％（P＜0.05）；水提取物3种浓度的含药血清对HBeAg和HBsAg都有较好的抑制作用，抑制率分别达到了70％和30％以上（P＜0.05）。提示田基黄中的水溶性化学成分对HBeAg和HBsAg存在较稳定的抑制作用，并且没有明显的量效关系；同时各极性部位单独用药对HBeAg的抑制效果明显优于混合用药的抑制效果。
       
       对肝癌BEL-7404细胞的影响实验结果显示：田基黄不同提取物对肝癌BEL-7404细胞都有较好的抑制作用，该抑制作用呈现明显的量效关系，当含药血清浓度为20％时，乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的抑制率分别为29.74％，53.80％，40.79％和54.24％（P＜0.01）。提示田基黄抗肝癌的有效成分均衡分布于各种极性部位中，而且各极性部位单独用药的效果要优于混合用药的效果。
       表1  田基黄不同提取物的血清在2215细胞培养中对乙肝HBeAg和HBsAg的抑制作用（略）
       与细胞对照组比较，①表示P＜0.01，②表示P＜0.05，③表示P＞0.05；n=3
       表2  田基黄不同提取物的血清对肝癌BEL-7404细胞的抑制作用（略）
       与空白血清组比较，①P＜0.01，②P＜0.05，③P＞0.05；n=6
       3  讨论
          
       中药血清药理学是指在动物经口服给药后一定时间采血分离血清，用此含药血清进行体外实验的一种实验方法［6］。这种新的实验方法可排除在体外实验中各种干扰因素的影响，比较接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程。作者利用血清药理学方法，研究田基黄不同提取物在体外对2215细胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用和对肝癌BEL-7404细胞的抑制作用，结果表明田基黄不同提取物含药血清有良好的体外抗乙肝和抗肝癌作用。其抗乙肝的有效成分主要分布在的水提取物中，今后可以考虑从水层部位筛选出活性更强的抗乙肝单体化合物。抗肝癌的有效成分均衡分布于各种极性部位，并且各极性部位单独用药对肝癌BEL-7404细胞的抑制效果明显优于混合用药的抑制效果，今后可以考虑从这几个活性部位中筛选出活性更强的抗肝癌单体化合物。实验结果显示空白血清组的OD值与无血清细胞对照组的OD值无显著性差别（P＞0.05），说明血清对实验没有干扰。至于田基黄是通过何种途径实现其抑制2215细胞分泌HBeAg和HBsAg，以及抑制肝癌BEL-7404细胞生长的，还有待于进一步研究；而其具有抑制作用的化学单体有哪些，还有待于进一步筛选。
       【参考文献】
         　　［1］ 《中华本草》编委会．中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：598.
       
       ［2］ 陈丽云，杨立伟，苏薇薇，等．田基黄及其注射液的研究进展［J］.中药材，2002，25（7）：525．
       
       ［3］ 顾明国，冯淑珍，王小燕．地耳草抗疟有效成分的研究——地耳草素A，B，C，D的分离和结构［J］.化学学报，1988，46(3)：246．
       
       ［4］ 郁建平，古练权，周 欣．田基黄茎、花叶挥发油化学成分的研究［J］.中国药学杂志，2001，36（3）：199．
       
       ［5］ 孟 李，王宁生．含药血清的制备方法研究［J］.中药新药与临床药理，1999，10（5）：290．
       
       ［6］ 赵万红，曹永孝，袁泽飞．中药血清药理学的方法学探讨［J］.中药新药与临床药理，2002，13（2）：122．