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       【摘要】 
       目的观察五加皮多糖对体外培养人宫颈癌细胞hela的凋亡作用。方法苯酚-硫酸法提取五加皮多糖，采用MTT法、DNA琼脂糖凝胶电泳法及流式细胞术检测五加皮多糖对人宫颈癌细胞增殖抑制及凋亡作用。结果经五加皮多糖24，48 h作用后的hela细胞，应用MTT法测出对细胞有明显的抑制作用；经不同浓度五加皮多糖作用的hela细胞电泳均出现相差约200 bp的DNA梯子状条带；流式细胞仪检测后发现，不同浓度五加皮多糖处理hela细胞，细胞增殖受到明显抑制。结论五加皮多糖抑制体外培养的人宫颈癌hela细胞的生长，诱导其细胞凋亡。
       【关键词】  五加皮多糖 hela细胞 凋亡 抑制率
       五加皮为五加科落叶小灌木细柱五加的根皮，常在夏、秋二季采挖，剥取根皮，晒干。其功效为散风祛湿，利水消肿，益肝肾壮筋骨［1］。古医书中也有报道五加皮用于治疗骨癌、肝癌、肾癌等肿瘤的记载［2］。且现代药理研究还发现红毛五加皮多糖、刺五加皮多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用。本文就五加皮多糖的体外抗肿瘤作用［3，4］，来探讨对人宫颈癌hela细胞的凋亡［5～7］机制，为五加皮多糖的研究和开发探讨新的思路。
       1  器材
          
       人宫颈癌hela细胞购自北京肿瘤研究所遗传室，后经本院实验中心细胞室传代冻存。五加皮多糖购自河北北方学院中医门诊；琼脂糖、200 bpDNAmaker 为六合通公司产品；碘化丙锭综合染液购自晶美生物工程公司；RNase  A，Bovine pancreas为华美生物工程公司；其他均为国产分析纯试剂。美国FACSAria流式细胞仪等。
       2  方法
       2.1  细胞培养 细胞培养用DMEM高糖培养基 ；加入10﹪胎牛血清，庆大霉素100 μl/ml，7.6﹪NaHCO3调至pH 7.4。复苏细胞放置37℃ 5%的CO2培养箱中进行培养。每天更换一次培养基。当细胞生长至对数生长期加五加皮多糖处理。
       2.2  MTT法取对数生长期的hela细胞，用胰酶消化约4 min，计数密度为5×104/ml的hela细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，待细胞贴壁后每孔加入16.8 mg/ml五加皮多糖（0，20，40，60，80，100 μl），共6组，每组4个平行孔，用培养基补至200 μl/孔，五加皮多糖最终浓度分别为0，0.525，1.05，2.1，4.2，8.4 mg/ml。置37℃，体积分数为5﹪CO2条件下分别培养24，48，72 h，加入MTT (浓度5 mg/ml，10 μl/孔)，继续培养4 h后，弃上清液, 每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μl，10 min后置酶联免疫检测仪上测各孔光密度(OD)值，波长为492 nm，计算平均OD值和抑制率。
       2.2.1  五加皮多糖制备称取已干燥粉碎的五加皮制成232 g，加入1 000 ml体积分数0.85乙醇回流提取1 h,滤过，滤渣加入1 000 ml三蒸水回流提取2 h,过滤，滤渣再加入1 000 ml三蒸水回流提取2 h,合并两次滤液，减压浓缩至适量，4倍无水乙醇醇沉，静置过夜，过滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，即得五加皮多糖。制成16.2 mg/ml的溶液，高压灭菌4℃保存。
       2.2.2  流式细胞仪分析按上述方法收集细胞，用磷酸缓冲液洗（pH 7.4）3次，7 000 g/min，8 min后去上清，加2 ml缓冲液计数细胞1×106，加入碘化丙啶综合染液1 ml染色30 min，在流式细胞仪上观察细胞周期。
       2.2.3  DNA琼脂糖凝胶电泳分析取对数生长期细胞6瓶，每瓶共含有1×106个细胞，用细胞培养液把稀释五加皮多糖稀释成不同浓度（0，1.344，2.688，4.032，5.376，6.72 mg/ml），分别加入6个培养瓶中，加培养液至5 ml。培养48 h后用原有培养液吹起细胞，收集离心，吸去上清液，加入1 ml磷酸缓冲液洗两次。然后提取DNA，在2﹪琼脂糖凝胶上电泳2 h，电压为80 V，紫外透视仪观察、拍照。
       2.3  MTT法 测定五加皮多糖对hela细胞的增殖抑制作用。不同浓度五加皮多糖作用于hela细胞，对hela细胞的生长具有不同程度的抑制作用。在培养24～48 h过程中，五加皮多糖对hela细胞的抑制作用逐渐增加，并随药物浓度的增加，对hela细胞的抑制率逐渐升高，其抑制率见表1。
       表1  五加皮多糖对hela细胞增殖的影响（略）
       *代表24 h和48 h的1～5组对hela细胞抑制率的对比呈显著差异
       2.4  DNA凋亡带的观察Hela细胞经不同浓度五加皮多糖处理48 h后，仅第5组可见断裂DNA片段，表明经一定量五加皮多糖处理后hela细胞可出现DNA梯子状条带（DNA ladder）。
       2.5  细胞周期的检测经细胞周期测定结果显示，未经五加皮多糖处理的hela细胞，经 48 h培养 G0/G1期细胞占27.75%。S 和G2+M期细胞分别占63.21%和9.04%。经五加皮多糖处理的hela细胞 G0/G1期细胞增加至31.85%, 而 S 和 G2/M 期细胞分别降至42.00%和6.17%，凋亡率增加到19.98%。提示五加皮多糖可以抑制细胞DNA合成和细胞分裂，诱导细胞凋亡，从而抑制细胞的增殖。
       3  讨论
          
       宫颈癌是全球妇女中发病率仅次于乳腺癌而占第2位的恶性肿瘤。在美国，宫颈癌占妇科恶性肿瘤的第3位。据1994年美国统计结果，宫颈癌总发病率为8.7/10万，总病死率为3.0/10万。杨大望［8］在1985年总结了25个省市自治区约800万宫颈细胞学筛查结果，宫颈癌患病率为138.74/10万,其中以甘肃、安徽、陕西地区宫颈癌患病率最高，分别为502.56/10万，444.02/10万，404.00/10万。近二十多年来，由于加强了宫颈癌前病变的诊断和治疗，使宫颈癌的发病率降低了约20%。传统中医药积累了大量治疗妇科疾病的经验与验方，辨证论治对减少宫颈癌化疗和放疗的副作用均有较好的治疗作用［9，10］，这对巩固和加强宫颈癌的治疗效果，延长患者生命和保证生存质量具有积极意义的。目前，中药区别于西药的最大特点，就是其有效成分和作用机制十分复杂、难以解说，这也是中药现代化研究长期少有突破的症结所在［11～13］。关于单味中药作用机制研究的报道很少,而有关五加皮的研究报道则几乎为零。关于五加皮活性成分五加皮多糖的抗宫颈癌的研究机制还未见报道，本研究为五加皮多糖抗癌研究的重点提供了有价值的参考资料。
         
       肿瘤的发生有其遗传物质基础,主要表现为多基因突变所致的细胞失控性生长,细胞增殖失控和凋亡受阻是其发生、发展的主要原因［14］，有效的诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一［15］。细胞凋亡是机体清除损伤、衰老和突变细胞、维持自身稳定的一种基本生理机制［16］。它与癌症的发生和发展有着密切的关系［17］。五加皮多糖对hela细胞的体外抑制肿瘤［18］实验结果显示，五加皮多糖对肿瘤细胞株hela细胞有较强的抑制作用，而且有较好的时间依存关系。本实验为了研究五加皮多糖对肿瘤细胞的作用机制，将不同时间段和不同剂量五加皮多糖作用于hela细胞后，hela细胞的生长受到明显抑制，有凋亡带的出现。结果显示不同时效和不同的药物浓度，尤其是作用48 h后出现的凋亡带最为明显，说明五加皮多糖能诱导明显的细胞凋亡［19，20］。同时我们还检测了五加皮多糖对hela细胞周期的作用。流式细胞技术测定细胞DNA含量结果显示，肿瘤细胞经五加皮多糖处理48 h后，阻止细胞周期向 S 期、G2/M 期进展，出现明显的细胞凋亡亚二倍体峰。提示五加皮多糖不仅抑制肿瘤细胞增殖，还可以诱导细胞凋亡。
       【参考文献】
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