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       【摘要】 
       目的研究中药复方妍婷颗粒对脂多糖（LPS）诱导小鼠脾细胞产生白介素-1β（IL-1β）的影响，初步探讨妍婷颗粒对慢性盆腔炎免疫调节的内在机制。方法对经LPS诱导的小鼠脾细胞给予不同浓度妍婷颗粒含药血清进行干预，用ELISA法检测上清液中IL-1β含量，用RT-PCR法检测细胞中IL-1β mRNA的表达。结果①正常小鼠脾细胞合成和分泌少量IL-1β，经LPS诱导后IL-1β分泌量明显升高（P<0.01），IL-1β mRNA表达增强。②不同浓度妍婷颗粒干预呈剂量依赖方式降低LPS诱导的小鼠脾细胞IL-1β的分泌量与表达（P<0.01）。结论妍婷颗粒具有抑制LPS刺激小鼠脾细胞产生IL-1β的作用，据此推测妍婷颗粒抗炎、免疫调节作用机理可能与其抑制脂多糖介导的IL-1β释放有关。
       【关键词】  妍婷颗粒 脂多糖 小鼠脾细胞 白介素-1β
       妍婷颗粒方为导师侯丽辉教授多年临床经验与中医理论相结合，总结出的治疗慢性盆腔炎的经验方，已在临床广泛应用多年，且疗效显著。慢性盆腔炎是妇科常见病、多发病，有缠绵不愈、易于复发的特点，近年其发病率呈上升趋势，因此对慢性盆腔炎的认识与研究日益广泛和深入。IL-1具有广泛的免疫调节、致热、介导炎症等作用，是慢性盆腔炎发生发展的一种重要细胞因子。本研究观测妍婷颗粒对LPS诱导小鼠脾细胞产生IL-1β的影响，从分子免疫学角度探讨妍婷颗粒治疗慢性盆腔炎的机理和有效性。
       1  器材
       1.1  仪器与试剂超净工作台（苏州净化）， 二氧化碳培养箱（SHEL·LAB）， 台式高速离心机(BECKMAN)， 电热鼓风干燥箱（天津泰斯特）， AB204型电子天平(Sartorius)，磁力加热搅拌器78-1（江苏金坛）， 双蒸水馏器(MILLI-Q)，752型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）， PCR仪(Eppendorf), 稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）。
       
       改良型RPMI-1640培养液(Hyclone)，胎牛血清（杭州四季青），D-PBS（北京中山金桥）， LPS (Sigma)，Trizol(Lnvitrogen), 引物(Sangon), 氯仿（天津市天大化学试剂厂），异丙醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），琼脂糖(Solarbio)，PCR所需试剂购自Promega及TakaRa公司，ELISA试剂盒（北京北方生物技术研究所）。
       1.2  动物6～8周龄昆明雌性小鼠，体重20～25 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
       1.3  药物  妍婷颗粒方组成：丹参、赤芍、元胡、三棱、莪术、红藤、败酱草、皂刺、川楝子。药物来源于黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室，制成中药颗粒剂，蒸馏水溶解，最后浓缩含生药浓度为1.75 g/ml。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备取体重20～25 g的正常昆明雌性小鼠，按人鼠体重比换算后，以妍婷颗粒方灌胃（20 ml/kg，约相当于成人用量的7倍），2次/d ，连续3 d，最后1次给药后2 h，颈动脉取血，以2 000 r/min离心5 min，分离血清，并于57℃灭活（30 min），－20℃冻存备用［1］。
       2.2  小鼠脾细胞的分离培养小鼠颈椎脱位处死，置75%乙醇中浸泡3～5 min，仰卧位，无菌取脾脏，用D-PBS液冲洗，置于平皿中，移入超净工作台，再以滤过的D-PBS快速、充分洗涤后，置于烧杯上的200目不锈钢网，将脾组织用眼科剪剪成小块，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮状，D-PBS液冲洗过滤脾细胞，收集细胞悬液无菌离心管中，1 500 r/min离心10 min，使细胞沉淀，弃上清，再以D-PBS液洗涤细胞2次，RPMI-1640培养液洗涤细胞1次(均以1 500 r/min离心10 min)。以RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清，含有青霉素、链霉素各100 u/ ml）悬浮细胞，0.4%台盼蓝染色显示活力，细胞存活数大于90%，调整细胞密度，按1×106/ml密度接种细胞，置37℃，5%CO2培养箱中培养。培养12 h后加LPS及不同浓度妍婷颗粒进行干预（LPS浓度为10 μg／ml［2］；妍婷颗粒浓度分别为培养基的5%，10%，20%［1］）。
       2.3  实验分组实验分组为正常组；LPS处理组（10 μg／ml）；5%妍婷颗粒＋LPS处理组；10%妍婷颗粒＋LPS处理组；20%妍婷颗粒＋LPS处理组。
       2.4  实验检测给予LPS及妍婷颗粒干预24 h［3］后收集上清及细胞。
       2.4.1  培养液上清中IL-1β含量测定收集上清液－20℃冰箱保存，按ELISA试剂盒说明进行检测。
       2.4.2  RT-PCR法检测细胞中IL-1β mRNA的表达用Trizol提取细胞总RNA,测总RNA纯度和含量,逆转录成cDNA, IL-1β的上游引物为:5＇-AGG CTC CGA GAT GAA CAA-3＇；下游引物为: 5＇-AAG GCA TTA GAA ACA GTC C-3＇, 产物长度为464bp, PCR总反应体为25μl。扩增条件为：95℃预变性5 min，然后在90℃ 30 s，52.5℃ 30 s，72℃ 30s条件下循环30～35次，最后72℃延伸10 min。PCR产物以 15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,自动凝胶成像分析仪下观察并保存图像，IL-1β相对含量以“（细胞因子基因表达密度/GAPDH表达密度)×100%”表示［4］。
       2.5  统计学分析实验数据用±s表示,采用SPSS11.0for windows统计软件进行统计学处理分析,组间比较采用方差分析。
       3  结果
       3.1  各组细胞上清液IL-1β浓度变化    LPS 组分泌IL-1β比正常组多,差异有显著性(P<0.01 ) 。含妍婷颗粒组(5%妍婷颗粒＋10μg/ ml LPS，10%妍婷颗粒＋10μg/ ml LPS，20%妍婷颗粒＋10μg/ ml LPS) IL-1β分泌量比 LPS组低,差异显著性逐渐增强( P>0.05,P<0.05,P<0.01)。见表1。
       表1  妍婷颗粒对LPS介导小鼠脾细胞分泌IL-1β的影响（略）
       与正常组比较，●P<0.01；与LPS组比较，★P>0.05，★★P<0.05，★★★P<0.01
       3.2  RT-PCR检测细胞中IL-1βmRNA的表达正常组IL-1βmRNA的表达较弱,LPS 组IL-1βmRNA的表达明显增强,含妍婷颗粒组IL-1βmRNA的表达逐渐减弱。见图1。
       图1  妍婷颗粒对小鼠脾细胞IL-1β mRNA表达的影响（略）
       4  讨论
          
       慢性盆腔炎往往是多种病原体的混合感染，其中包括大肠杆菌、脆弱类杆菌、淋病奈氏菌、沙眼衣原体等多种革兰氏阴性菌（G-），脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌（G-）细菌感染的主要致病因子［5］。LPS也称细菌内毒素，是构成革兰氏阴性菌（G-）细胞外壁的主要成分，可以从活体菌上缓慢释放，菌体破碎后大量释放到周围环境中［6］。LPS是一种有效的免疫刺激剂，也是机体天然免疫系统识别的主要靶分子，它通过持续刺激机体细胞系统，可被宿主脂多糖结构识别受体（如信号识别受体TOIL样受体4，TLR4）识别，从而激活一系列信号转导通路，激发免疫应答，诱导细胞因子（如IL-1、TNF-α等）的转录表达，产生炎症级联反应。实验已证明，LPS可诱导单核细胞、巨噬细胞、B细胞等多种细胞产生炎症反应［7］。本实验据此建立免疫炎症模型［8］，探讨中药妍婷颗粒免疫调节、抗炎治疗的机理和有效性。
       
       细胞因子是一种由细胞产生的，具有调节细胞功能的高活性、多功能的蛋白质多肽分子，其功能为调控细胞增殖、生长、分化和代谢活动［9］。白介素-1（IL-1）不仅作为一种重要的细胞因子，是体内调节免疫和炎症反应的中心介质，也作为神经递质和生长因子参与机体多个系统的病理生理活动。近年对IL-1的研究日益深入，其在各系统中的作用与机制得到相应证实，为一些临床疾病的诊治提供了有力依据。IL-1主要由淋巴细胞、单核－巨噬细胞产生，B细胞、单核－巨噬细胞在LPS等刺激剂作用后，合成和分泌大量IL-1（主要是IL-1β为主）［10］。IL-1被称为前炎症因子［11］，机体受到感染或创伤时，由淋巴细胞、单核－巨噬细胞最早产生的细胞因子IL-1，启动炎症级联反应，刺激体内多种细胞产生各种趋化因子（如补体片断C5a，白细胞三烯LTB4，中性阳离子蛋白），促进多种免疫分子（如TNF-α，黏附分子等）基因表达和中性粒细胞释放炎症蛋白、炎症介质（如组胺、缓激肽、前列腺素），这些细胞因子在慢性盆腔炎的发生发展中起着重要作用。
       
       中医学认为慢性盆腔炎的发生多由于经期、产后摄生不慎，感受湿、热、寒邪乘虚客于冲任、胞宫，邪正交争，气血运行不畅，搏结成瘀所致，血瘀气滞是本病发病关键，中医药在治疗慢性盆腔炎方面有副作用小、疗效高的优势。妍婷颗粒方为导师侯丽辉教授治疗慢性盆腔炎的经验方。方中赤芍、丹参清热凉血，活血祛瘀，调经止痛；延胡索、三棱、莪术、川芎共奏活血散瘀，行气消积止痛之功；红藤、败酱清热解毒，活血止痛；皂角刺托毒排脓，活血消肿。诸药合用，共同达到行气活血，化瘀通络止痛的作用，抑制免疫炎症因子IL-1β的释放。现代药理研究证明［12］，妍婷颗粒方组成药物具有抗菌、抗炎、改善血液流变性、抑制结缔组织增生，使纤维溶解，抑制凝血，增强免疫的作用。本实验结果也表明，妍婷颗粒具有抑制免疫炎症因子IL-1β合成和释放的功效,至于其调节免疫、抑制炎症反应的具体环节有待于进一步研究。
       【参考文献】
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