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       【摘要】 
       目的研究泽泻提取物不同部分的自由基清除活性。方法采用有机溶剂萃取法和大孔树脂洗脱法将泽泻总提取物分为石油醚部分、醋酸乙酯部分、正丁醇部分、乙醇部分、乙醇洗脱部分和水提部分。分别考察对羟自由基(·OH) 、超氧阴离子自由基(O2-·) 、DPPH自由基(DPPH·) 和H2O2的清除效果。结果泽泻正丁醇部分在清除O2-·和H2O2能力较强，醋酸乙酯部分清除DPPH·较强，而泽泻水提部分清除·OH自由基能力较强，而且效果好于维生素C。结论泽泻正丁醇部分、醋酸乙酯部分和水提部分清除自由基能力强。
       【关键词】  泽泻 DPPH 超氧阴离子自由基 羟自由基
       Free Radical Scavenging Activity of the Extracts from Alisma orientalis
       ZHANG Jianping, YI Xing*, XIAO Xiaonian
       (Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang, 330047, China;Sino -German Food Engineering Center, Nanchang University, Nanchang, 330047, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate free radical scavenging activity in vitro of different polarity fractions of extracts from Alisma orientalis. MethodsSix different fractions were obtained from the extract of A. orientalis by using different polarities of solvents, such as petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol, ethanol, water, and macroporous resin. According to scavenging activities for hydroxyl radical (·OH), superoxidized radical (O2-·), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH·) radical and H2O2, free radical scavenging activities of different polarity fractions were compared.Resultsn-butanol fraction of A.Orientalis had better scavenging ability than others for O2-· and H2O2, ethyl acetate fraction of A. Orientalis had better scavenging ability than others for DPPH·, water fraction of A. Orientalis had better scavenging ability than others for ·OH, including Vitamin C.ConclusionThe fractions of ethylacetate, n-butanol and water have strong free radical scavenging activities.
       Key words：Alisma orientalis;  DPPH;  Superoxide free radical;  Hydroxyl radical
       
       泽泻系泽泻科植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep.的干燥块茎,在历代本草和《中国药典》中均有收载。现代药效学研究表明,泽泻具有利尿消肿、抗脂肪肝、降血脂等作用［1～3］。有研究报道，泽泻总提取物能降低大鼠和兔血液中脂质过氧化产物MDA的含量，提高血液中抗氧化酶SOD活力，对于氧化应激/脂质过氧化损伤具有一定保护作用［4］。为了明确泽泻抗氧化的作用部位，笔者采用有机溶剂萃取法和大孔树脂洗脱法，将泽泻的总提取物分为石油醚部分、醋酸乙酯部分、正丁醇部分、乙醇部分、乙醇洗脱部分和水提取部分，分别对提取物的各部分进行了清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·自由基和H2O2效果的研究，为进一步探讨泽泻提取物的抗氧化性能提供依据。
       1  器材
          
       泽泻，购自江西广昌,按中药炮制规范得到饮片,再粉碎得到20目颗粒；乙醇、石油醚、正丁醇、醋酸乙酯、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、Vc、FeSO4、双氧水、水杨酸、DPPH·均为分析纯。
       
       T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），N-1001型旋转蒸发仪（东京理化公司），TDL-5型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），AR5120型电子天平（美国奥豪斯公司）。
       2  方法
       2.1  泽泻提取物的制备取泽泻颗粒，去离子水提取，浓缩，提取液乙醇醇沉，静置24 h，5 000 r/min离心10 min,取上清液，浓缩到原体积的1/4后，分别用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取。最后将萃取水相过大孔树脂，用95%乙醇洗脱，分别得到泽泻水提部分、醇提部分、石油醚部分、醋酸乙酯部分、正丁醇部分和乙醇洗脱部分6个部分，将各部分浓缩后，配成一定浓度溶液，放置备用。
       2.2  超氧阴离子自由基［5］的清除邻苯三酚在弱碱条件下发生自氧化，产生O2-·。O2-·清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325 nm处的吸收峰减弱，通过吸光值A325的变化率计算对O2-·的清除能力。取4 ml 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2），置于25℃水浴中预热20 min，分别加入1 ml待测液和1 ml 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入0.1 ml 8%的HCl终止反应，在325 nm处测A值，以1 ml蒸馏水代替待测液作空白试验。以维生素C作阳性对照。
       
       清除率(P)=［A3-(A1-A2)］/A3×100%
       
       其中A1为某浓度的泽泻提取物吸光值，A2不加入邻苯三酚无显色时的吸光值，A3不加泽泻提取物的吸光值。
       2.3  羟自由基［6］的清除利用Fe2+与H2O2混合产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。反应试管中加入0.5 ml 9 mmol/L FeSO4，0.5 ml 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液及1 ml不同浓度的泽泻提取物，最后加5 ml 9 mmol/L H2O2启动反应。37℃温浴1 h，于510 nm处测A值。以维生素C作阳性对照。
       
       清除率(P)=［A3-(A1-A2)］/A3×100%
       
       其中A3为对照不加泽泻提取物的吸光值；A1为某浓度泽泻提取物的吸光值；A2为无显色剂时的该浓度的本底值。
       2.4  DPPH·自由基［7］的清除DPPH·是一种稳定的自由基，与抗氧化剂发生反应，提供H·被还原，颜色由深紫色变为淡黄色，当有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使颜色变浅，变浅的程度与配对电子数成化学计量关系，因此，我们可以通过吸光度的测定来检测自由基的清除情况,从而评价试验样品的抗氧化能力。按照Larrauri方法，2 ml新配制的20 mmol/L DPPH·溶液中加入2 ml不同浓度的泽泻提取物，室温暗光下反应30 min，在517 nm处测定A值，以维生素C作阳性对照。
       
       清除率(P)=［A3-(A1-A2)］/A3×100%，其中A1为加入泽泻提取物和DPPH·时的吸光值；A2为加入泽泻提取物但不加入DPPH·时的吸光值；A3为不加泽泻提取物，加入DPPH·时的吸光值。
       2.5  H2O2［8］的清除H2O2自身没有活性，但它在细胞组织里可产生·OH，从而对细胞有毒副作用［8］。因此，清除H2O2对细胞和食物体系的抗氧化防御有十分重要的意义。在10 ml具塞试管中加入2.8 ml 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)配制的0.5 mmol/L H2O2溶液,再加入0.4 ml泽泻提取物,反应10 min后,于230 nm处测定A值,以同浓度的维生素C为对照品,计算清除率。
       
       清除率(P)=(A1-A0)/A0×100%
       
       其中,A0为不含泽泻提取物的吸光值；A1为含泽泻提取物的吸光值。
       3  结果与分析
       3.1  泽泻提取物清除超氧阴离子自由基的能力泽泻提取物各部分清除超氧阴离子自由基的能力见图1。从图中可以看出，随浓度增大，泽泻提取物各部分的清除率也随着增大。正丁醇部分在浓度大于4 mg/ml时，其清除超氧阴离子自由基能力要高于对照品维生素C，而石油醚部分总体清除超氧阴离子自由基能力最弱。
       图1  泽泻提取物清除超氧阴离子自由基能力（略）
       3.2  泽泻提取物清除羟自由基的能力泽泻提取物各部分羟自由基清除能力见图2。由图2看出，水提部分清除羟自由基的能力最强，在浓度10 mg/ml时，其清除率达到99.71%；乙醇洗脱部分次之，正丁醇部分和石油醚部分则总体较弱。
       图2  泽泻提取物清除羟自由基(·OH)能力（略）
       3.3  泽泻提取物清除DPPH·的能力泽泻提取物各部分DPPH·清除能力见图3。由图3看出，各部分清除能力随浓度增大而增强。醋酸乙酯部分在浓度为1～10 mg/ml间，清除率均较高，其清除率都在92.39%以上；各部分清除DPPH·能力由大到小顺序为：醋酸乙酯部分＞对照品维生素C＞乙醇洗脱部分＞正丁醇部分＞乙醇部分＞水提部分＞石油醚部分。
       图3  泽泻提取物清除DPPH·能力（略）
       3.4  泽泻提取物清除H2O2的能力泽泻提取物各部分H2O2清除能力见图4。由图4看出，除泽泻提取物正丁醇部分清除H2O2能力稍强外，泽泻提取物其余部分清除H2O2的能力均较弱，当浓度小于6 mg/ml时清除效果不明显，且在6～8 mg/ml间只有小幅增加。
       图4  泽泻提取物清除H2O2能力（略）
       4  讨论
          
       从实验结果看到，泽泻醋酸乙酯部分表现出高清除DPPH·的能力，水提部分则表现出较高的清除羟自由基能力，正丁醇部分除清除超氧阴离子自由基能力较高外，同时还有一定的清除H2O2能力，因此，泽泻提取物具有较高的自由基清除能力。现代研究表明，自由基在细胞内可发生多位点损伤，这些损伤的积累会促使机体老化和引发诸如癌症、高脂血症、糖尿病等相关疾病。泽泻的自由基清除能力较高，推测可以对抗或减低上述损伤的发生或发展，这与《神农本草经》记载泽泻有养五脏益气力久服耳目聪明、延年轻身的作用相吻合，可为阐述泽泻的作用机制提供依据。
       
       随着年龄增长，体内氧自由基水平、脂质过氧化产物及DNA损伤在不断增加，抗氧化酶活性及谷胱甘肽等还原性物质则呈现减少的趋势［9］，通过获取抗氧化剂来应对自由基的损伤是一条重要的途径。国家卫生部在2002-03已经明确,泽泻可用作保健食品的原料，由此预测，泽泻作为保健食品原料具有诱人的前景。
       【参考文献】
         　　［1］ 龚树生,张建军,曹广智,等.泽泻的历史及生物活性成分研究进展［J］.山西中医学院学报,2000,1(1):28.
       
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       ［3］ 徐 辉. 泽泻药理作用进展［J］.湖南中医杂志,2004,20(3):77.
       
       ［4］ Hong XZ, Tang HQ, Wu LM, et al. Protective effects of the Alisma orientalis extract on the experimental nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Pharmacy and Pharmacology［J］.2006, 58(10): 1391.
       
       ［5］ 张京芳,王冬梅,周 丽,等. 香椿叶提取物不同极性部位体外抗氧化活性研究［J］.中国食品学报,2007,10(5)：12.
       
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