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       【摘要】 
       目的优选连翘中齐墩果酸的提取工艺。方法以齐墩果酸含量为指标，采用L9(34)正交设计实验，考察了提取时间、乙醇浓度、料液比对提取率的影响,优选出合理的提取工艺。用高效液相测定齐墩果酸的含量。结果优选出齐墩果酸的最佳提取工艺条件是：超声提取3次，40 min/次，90%乙醇溶液，料液比1∶12。结论采用此工艺提取方法快速、简单，可以为进一步研究连翘提供参考。
       【关键词】  正交实验 齐墩果酸 连翘
       Optimization of the Extraction Process of Oleanolic Acid from Fructus Forsythiae by Orthogonal Design
       YU Shuxian, 　XIONG Shiquan
       （Department of Chemistry，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330031 China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction condition of oleanolic acid from  Fructus Forsythiae．MethodsWith oleanolic acid as index，extraction time、concentration of alcohol and amount of alcohol and were evaluated by L9(34)orthogonal design method．HPLC was used to analyze the content of oleanolic acid．ResultsThe optimum extraction condition was described as follow：ultrasonic extraction 3 times (once 40 min)，90% ethanol solution, and 12-fold solvent．ConclusionThe optimized technology is quick and simple，and can be used for theoretical basic．
       Key words：Orthogonal design;   Oleanolic acid;   Fructus Forsythiae
       
       中药连翘是木犀科连翘属植物的干燥果实，主产山西、河南、陕西,有广谱的抗菌作用，如对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌等有不同程度的抑制作用，有镇吐、解热、抗炎以及保肝作用，含有连翘苷、牛蒡子苷、齐墩果酸等［1］。齐墩果酸具有降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性、促进细胞再生、防止肝硬化、抗炎等作用，是治疗肝炎的有效成分。近年有关研究证明其有抗癌活性。       
       
       《中国药典》［2］对连翘中的连翘苷进行了测定；孙国祥等［3］对连翘的HPLC指纹图谱进行了研究；张杲等［4］对不同采收期连翘进行了HPLC指纹图谱研究；邹盛勤［5］对不同采收期连翘中的熊果酸和齐墩果酸含量进行了测定；张涛等［6］对连翘不同炮制品中连翘苷进行了HPLC测定。
       
       本工艺以齐墩果酸的含量作为考察指标，采用单因素实验设计与正交实验设计相结合，用HPLC测定，优选连翘中齐墩果酸的提取工艺，以期为进一步研究连翘奠定基础。
       1   仪器与试药
       1.1   仪器日本Hitach公司高效液相色谱仪；L-2400型紫外检测器；Gold Spectrumlab 54 紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；KQ2200E型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)； PH-030干培两用箱（上海一恒科技有限公司）；RE - 52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）； Sartorius十万分之一电子天平(德国)。 
       1. 2   试药药材连翘购自江西省药材公司(产地山西)，经江西医学院冯江教授鉴定为正品连翘；齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检验所提供；甲醇为色谱纯,超纯水；其他试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1    色谱条件Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为甲醇-水-0.1%冰醋酸（92∶8∶0.1，V/V/V）；柱温：30℃；流速1 mL/min；检测波长215 nm。
       2.2    检测波长的确定取对照品溶液，经紫外分光光度计在200～500 nm范围内扫描得知，对照品溶液在203，207，210 nm等处有吸收，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了减少干扰, 因此选择最大的215 nm作为测定含量的吸收波长。
       2.3  对照品溶液的制备  取对照品105℃恒温干燥至恒重，精密称取10.3 mg齐墩果酸对照品，置10 ml容量瓶中，用流动相溶解，超声5 min，定容至10 ml，得到1.03 mg/ml的对照品溶液。
       2.4    标准曲线和线性范围的考察 依次精密吸取对照品溶液0.1，0.5，2，3，4 ml后，置10 ml容量瓶中，再加10 ml流动相溶解稀释，分别取10 μl进样3次，记录峰面积，以峰面积值(Y)对齐墩果酸的浓度(X )进行线性回归，得回归方程为Y=3 980 023X-28 536, r=0.999 8。结果表明齐墩果酸在0.01～0.4 mg/ml范围内线性关系良好。
       2.5  单因素实验
       2.5.1    提取时间对连翘中齐墩果酸提取量的影响准确称量连翘1 g共15份，分成5组，每组实验重复3次，分别加12倍量的90%乙醇超声提取，5组提取时间分别为20，30，40，50，60min，分别测定齐墩果酸的含量,结果：40 min时提取的含量最大，40 min之前或之后提取量较小。
       2.5.2    乙醇浓度对连翘中齐墩果酸提取量的影响准确称量连翘1g共12份，分成4组，每组实验重复3次, 分别加12倍量的60%，70%，80%，90%的乙醇，超声提取40 min，3次，分别测定齐墩果酸的含量，结果：90%的乙醇提取的含量最大。
       2.5.3    料液比对连翘中齐墩果酸提取量的影响准确称量组方中的连翘1 g 共12份，分成4组，每组实验重复3次，加4，8，12，16倍量90%乙醇超声提取40 min，3次，测齐墩果酸含量。结果：12倍量的乙醇和16倍量的乙醇所得含量较大。
        从以上单因素实验分析，设计提取时间(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)、空白(D)为考察因素，每个因素各取3个水平。见表1。
       表1  因素水平（略）
       2.6    供试品溶液的制备及正交实验把连翘药材研碎，过40目筛，取恒温干燥至恒重的连翘药品，精密称取1g 9份，按表2设计先用石油醚脱脂2次，弃去石油醚，烘干，然后把药渣用乙醇溶液冷浸1 h，超声提取3次，过滤，合并滤液，蒸干，用流动相溶解、超声，过0.45 μm微孔滤膜，定容于10 ml容量瓶中，各取10 μl分别进样3次，记录峰面积，用面积外标法测定齐墩果酸的含量。见表2。
       表2  正交实验结果(L9(34))及极差分析（略）
       从极差的分析结果知道，RA>RB>RC，超声时间A的R值最大，也就是超声提取的时间影响最大，其次是浓度，影响最小的是料液比，因此较好的工艺条件是A2B3C3，即超声40 min，乙醇浓度是90％，料液比为1∶16，此时得到齐墩果酸的含量最大。为了进一步分析因素的可信度，还得进行方差分析。见表3。   
       从方差分析结果来看，超声的时间是最显著因素，其次是乙醇浓度，最后是料液比。因此，提取过程中，应把超声时间作为关键因素考虑，然后是乙醇浓度和料液比。
       表3   方差分析（略）
       2.7  方法学考察
       2.7.1  精密度实验  取同一对照品溶液各10 μl，按前述色谱条件，连续重复进样5次，测定峰面积值RSD为0.26%，说明仪器的精密度良好。
       2.7.2  稳定性实验  同一份供试品溶液分别隔4 h进样1次，在12 h内测定结果RSD为1.26％(n=5)，表明供试品溶液在12 h内稳定。
       2.7.3  重复性实验  取齐墩果酸对照品溶液，各重复进样5次，测定峰面积，结果齐墩果酸峰面积平均值为149 746，RSD＝0.64%(n＝5)。
       2.7.4  加样回收率实验  称取0.50 g已知齐墩果酸含量的连翘粉末6份，分为两组，分别在每组样品中加入1.0，1.5和2.0倍左右的齐墩果酸的对照品，按上述实验方法操作，在前述色谱条件下测定，计算加样回收率，结果平均回收率为97.43%， RSD为1.67%(n=6)。
       3  讨论
          
       从正交实验的结果及多次实验知道，料液比为1∶12和1∶16两者所得到的结果没多大区别，从考虑节约角度来说，选取1∶12较好，因此最佳的提取工艺是超声3次，40 min/次，乙醇的体积分数是90%，料液比为1∶12。
       
       从热回流、冷浸、索氏提取几种提取方法比较来看，同样条件下，超声所得的含量最大，且简单易行，因此选择超声作为提取的研究方法。
       
       因为连翘中还含有熊果酸，要分离齐墩果酸和熊果酸这对异构体，从Alltech ODS和KromasilC18分离的效果来看，C18分离效果较好，故选择了KromasilC18，加冰醋酸可提高两者的分离能力。
       【参考文献】
         　　［1］ 郑汉臣，蔡少青.药用植物学与生药学，第4版 ［M］.北京：人民卫生出版社，2005:360.
       
       ［2］ 国家药典委员会. 中国药典, 2005，Ⅰ部［S］. 北京: 化学工业出版社,2005: 117.
       
       ［3］ 孙国祥,慕善学,侯志飞,等. 连翘的HPLC指纹图谱研究［J］.中成药，2007，29（2）：161.
       
       ［4］ 张 杲,李发荣,段 飞，等. 不同采收期连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量测定［J］. 天然产物研究与开发，2005,17(6):790.
       
       ［5］ 邹盛勤. RP-HPLC法同时测定不同采收期连翘中乌索酸和齐墩果酸的含量［J］.沈阳药科大学学报，2007，24(3): 164.
       
       ［6］ 张 涛,陈学松. 连翘不同炮制品中连翘苷的HPLC测定［J］.中草药，2005，36（9）：1339.