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       【摘要】 
       目的以钻山风对照药材和肉桂酸作为对照，分别建立薄层（TLC）鉴别和高效液相色谱（HPLC）法检测控制钻山风颗粒剂的质量。方法TLC鉴别用三氯甲烷-甲醇（14∶1）为展开剂；HPLC法采用Hypersil BDS C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），用乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)为流动相，检测波长278 nm；柱温25℃；流速1.0 ml/min。结果TLC鉴别图谱斑点清晰，阴性无干扰；肉桂酸含量0.114 64～1.834 24 μg范围内呈良好线性关系，得回归方程Y=5×106X+97 402，r=0.999 9（n=6），平均加样回收率及RSD分别为99.67%和2.35%。结论以钻山风对照药材和肉桂酸作为对照，采用TLC法和HPLC法控制钻山风颗粒剂质量的方法简便快速、准确可靠、重复性好，专属性强。
       【关键词】  钻山风颗粒剂 薄层鉴别 高效液相色谱 肉桂酸
       类风湿性及风湿性关节炎属于中医学“痹证”范畴，中医认为是由于风、寒、湿之气杂而为病，闭阻经络病气血，痹阻关节、肌肉而发，故采用祛风、散寒、除湿及舒经通络等为治疗痹证的基本原则。我国人口众多，特别是随着老年化社会的逐渐到来，类风湿性及风湿性关节炎等疾病在临床上十分常见。因此与此相关的治疗药具有广泛的市场前景。钻山风糖浆是由钻山风、勾儿茶、四块瓦、威灵仙、千斤拔、丰城鸡血藤、山姜7味药组成的中药复方制剂，具有祛风除湿、散瘀镇痛、舒筋活络的功效，可用于风寒湿痹引起的腰膝冷痛，肢体麻木，伸屈不利等症。本实验室在原有钻山风糖浆的基础上［1］，开发了便于携带与服用的颗粒剂，可使患者拥有更多的选择，同时建立了新的质量控制方法，提高了新产品质量的可控性。
       1  器材
       1.1  仪器  高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)：P200 Ⅱ型高压恒流泵，UV200 Ⅱ紫外可变波长检测仪，Rheodyne 7725i 高压六通进样阀，20 μl定量环；HW色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；百万分之一电子天平（瑞士Mettler公司M3型）。
       1.2  试药  钻山风颗粒剂（由本实验室自制）；钻山风对照药材(中国药品生物制品检定所，批号121193-200402)；肉桂酸对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号0786-980）；乙腈、甲醇为色谱纯（中国医药集体上海化学试剂公司）；水为自制的重蒸水，其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  钻山风的薄层鉴别取本品15 g，研细，加氨试液60 ml，使其完全溶解，移入分液漏斗中，用氯仿振摇提取3次，30 ml/次，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；另取钻山风对照药材15 g，加水200 ml，煎煮30 min，离心，取上清液，蒸干，残渣同供试品溶液制备方法制得对照药材溶液。照薄层色谱法［2］实验，吸取对照药材溶液4 μl，供试品溶液10～20 μl，分别点于同一以0.2%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（14∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱主斑点相应的位置上，显相同颜色的斑点。
       2.2  肉桂酸的含量测定
       2.2.1  色谱条件 色谱柱为Hypersil BDS C18（5 μm，4.6 mm×250 mn）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)；使用前用孔径为0.45 μm的有机滤膜减压过滤，超声20 min；检测波长278 nm，柱温25℃，流速1 ml/min；进样量20 μl。
       2.2.2  可行性实验  精密称取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含肉桂酸约40 μg的溶液，即得，作为对照品溶液。取装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理［功率250 W，频率(26.5±1)kHz］30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过（0.45 μm滤膜），取续滤液，即得，作为供试品溶液。分别取肉桂酸对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1～3。
       图1  阴性对照样品（同时含钻山风和山姜）HPLC图谱（略）
       图2  肉桂酸对照品HPLC图谱（略）
       图3  钻山风颗粒剂HPLC图谱
       
       从图1～3中可知肉桂酸保留时间为19 min左右，阴性对照（同时含钻山风和山姜）在相应的位置处无干扰峰，说明本品在上述色谱条件下肉桂酸与其它组分分离较好。理论板数以肉桂酸计算不低于2000。
       2.2.3  线性关系考察  精密称取肉桂酸对照品2.866 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.114 6 mg/ml的对照品溶液。从中分别精密吸取1，2，4，8，12，16 μl注入色谱仪，测定其峰面积，以肉桂酸进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明在0.114 64～1.834 24 μg范围内进样量与峰面积积分值有良好线性关系，回归方程为Y=5×106X+97 402，r=0.999 9（n=6）。
       2.2.4  样品超声时间考察  取装量差异下的内容物约10 g，精密称定，称取3份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，分别超声15，30，45 min［250 w，（26.5±1） kHz］，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。依上述的方法测定，结果表明超声15，30，45 min的肉桂酸含量分别为0.235 8，0.252 7，0.244 7 mg/g，可知样品超声提取30 min即可。
       2.2.5  精密度实验  精密吸取对照品溶液20 μl，重复进样6次，求得肉桂酸峰面积积分值的相对标准偏差RSD为1.64%。
       2.2.6  稳定性实验  精密吸取20 μl供试品溶液，以第1次进针为0 h，分别在0，1，2，4，8，12 h进针，测定其中肉桂酸峰面积积分值，结果表明样品在12 h内稳定，RSD为1.80％。
       2.2.7  重复性实验  按样品测定项下方法，取同一批号钻山风颗粒剂样品6份, 精密称定，按供试品制备方法制备供试品溶液，照上述测试方法实验，6个实验样本平均含量为0.323 8 mg/g，RSD为2.20％。结果表明本法的重复性很好。
       2.2.8  加样回收实验  取本品已知含量，同一批号（批号20041001）样品共6份，每份约0.25 g，精密称定，精密加入一定量肉桂酸溶液，照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定肉桂酸含量（见表1）。结果表明本法回收率较高，方法可行。
       表1  钻山风颗粒剂的肉桂酸含量测定加样回收实验结果（略）
       回收率（%）=实测量-样品中的量对照品加入量×100%
       2.2.9  样品测定  按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，依上述色谱条件测定，计算1袋（3 g/袋）钻山风颗粒剂中肉桂酸含量，先后测定了10批样品，每批测2次（见表2）。依据测定的结果暂定本品每袋含钻山风和山姜以肉桂酸（C9H8O2）计不得少于0.5 mg。
       表2  钻山风颗粒剂样品的肉桂酸含量测定结果（略）
       3  讨论
          
       原糖浆剂的质量标准中只有1项为理化鉴别（有机酸的反应）和1项薄层鉴别（钻山风对照药材），没有含量测定项，理化反应鉴别专属性不强，故新标准中未采用该鉴别项。以钻山风对照药材为对照，鉴别钻山风中的生物碱成分，实验中根据实际情况，对供试品的处理方法及展开剂进行了调整，结果显示阴性实验无干扰，重复性好，斑点清晰，故建立了钻山风药材的薄层鉴别方法。
       
       钻山风为方中君药，也是方中的主要大组分药材，它本身就有祛风镇痛、活血化淤之功效。迄今为止，国内外学者从瓜馥木（又名钻山风）中已分离出20种化合物，有14种属于生物碱，2种为有机酸，一种黄酮，其余可分属于呋喃酮与环戊烯酮类化合物［3］。另据文献报道，钻山风和山姜中均含有肉桂酸，它有抗菌、抗炎、抗霉菌、升白细胞、抑制血栓素合成酶、抑制酪氨酸酶，并有使人肺腺癌细胞逆转作用，是一个具有良好应用前景的诱导分化剂。因此选择肉桂酸作为控制质量标准的指标之一，有一定意义。参照文献［4～6］，并结合本制剂的实际情况，通过对流动相不断摸索，采用高效液相色谱法测定颗粒剂中肉桂酸的含量，取得成功，方法简便可行，准确可靠，使制剂的质量更加可控。
       【参考文献】
         　　［1］ 中华人民共和国卫生部药政局.中华人民共和国卫生部药品标准 ·中药成方制剂，第10册［S］.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录ⅥB.
       
       ［3］ 彭新生，高幼衡，刁远明. 瓜馥木成分与药理研究进展［J］.江西中医学院学报，2004，16(5)：79.
       
       ［4］ 范亚岗，王 梅. HPLC法测定复方桂参合剂中肉桂酸的含量［J］.药品检测，2000，9(4)：36.
       
       ［5］ 徐向阳，张 蕙，陈 希. HPLC 法测定脉络宁口服液中肉桂酸的含量［J］.江苏药学与临床研究，2003，11(1)：14.
       
       ［6］ 罗晋萍，张中苏，田 晨. 高效液相色谱法测定桂龙咳喘宁胶囊中肉桂酸的含量［J］.药物分析杂志，2000，20(3)：200.