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       【摘要】 
       目的研究冬凌草甲素诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用原理及caspase途径在凋亡过程中的作用。方法噻唑蓝(MTT)法,形态学观察, RT-PCR及流式细胞法。结果冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞生长抑制作用呈时间剂量依赖性。形态学观察可见MDA-MB-231的增殖受明显抑制。冬凌草甲素可诱导细胞内抑制凋亡基因Bc1-xl表达量时间依赖性减少，促凋亡基因Bid表达量增加，caspase-3 的表达增加。40 μmol/L药物处理48 h后，流式法检测细胞凋亡率为75%。结论冬凌草甲素诱导MDA-MB-231细胞凋亡,这种作用可能是通过改变Bc1-xl/Bid的表达比率、 激活caspase-3 而实现的。
       【关键词】  冬凌草甲素 MDA-MB-231细胞 凋亡 Bc1-xl/Bid caspase-3
       Oridonin Induced MDA-MB-231 Cell Apoptosis through the Action of Caspase Pathway
       JIANG Yongqing, XIONG Xiangyang, YU Lehan
       1. Department of Biochemistry , Medical School, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330006, China; 2. Hospital of Jiujiang College, Jiujiang, Jiangxi 332000, China
       Abstract：ObjectiveTo study the mechanisms of oridonin-induced human breast cancer MDA-MB-231 cell apoptosis，and to examine the role of caspase pathway in the apoptosis process.MethodsMTT，observation of morphology, RT-PCR and flow cytometry．ResultsOridonin inhibited MDA-MB-231 cell growth in time-and dose-dependent manners,decreased the expression of antiapoptotic mitochondrial gene bcl—xl time-dependently，and increased the expression of  proapoptotic gene bid and caspase-3．The apoptosis rate was 75%  by flow cytometry after treatment  for 48 hours at the concentration of  40μmol/L. ConclusionOridonin maybe induce MDA-MB-231  cell apoptosis through alternation of the ratio of Bc1-xl/Bid and activation of caspase-3.
       Key words：Oridonin；  MDA-MB-231 cells；  Apoptosis；  Bc1-xl/Bid;  Caspase-3
       冬凌草甲素(oridonin)是从唇形科(Labtea)香茶菜属(Rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类(ent—kaurene diterpenoid)天然有机化合物，为无色棱柱状结晶，味道极苦，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂。冬凌草甲素能够抑制多种肿瘤细胞系的增殖，目前已经发表的研究主要是针对肝癌、白血病、淋巴瘤细胞，如K562［1］、HL - 60［2］，但尚未见到关于该药作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231的报道。本文以MDA-MB-231细胞为材料, 应用MTT、RT-PCR 、流式细胞仪研究了冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用及诱导MDA-MB-231细胞凋亡的机制。
       1  材料与仪器
       人乳腺癌细胞MDA-MB-231（由南昌大学医学院生物化学实验室保存）；冬凌草甲素（中药固体试剂制造技术国家工程研究中心）；10%胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；HyQ改良型1640培养基（海克隆生物化学制品北京有限公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Inviyrogen公司）；四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Solarbio公司）；二甲基亚砜(DMSO)（美国Amresco公司）；RT试剂盒（美国Fermentas公司）。15AC 5% CO2的培养箱（美国SANYO公司）；Gene Genius 全自动凝胶成像分析系统(英国Syngene公司)；4314型倒置显微镜（美国Cioc）；Facscallbar流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司)。
       2 方法
       2.1 细胞培养MDA-MB-231细胞，在含10%胎牛血清的HyQ改良型1640培养基，37℃、5% 的CO2饱和湿度培养箱中培养。
       2.2 细胞毒实验（MTT法）取对数生长期的MDA-MB-231细胞200 μl接种于96孔板中（2×104个/ml），培养48 h后加入不同浓度的冬凌草甲素(用DMSO溶解, 其浓度< 0.01 %)，每个药物浓度设5个平行复孔，另设DMSO对照组(DMSO浓度为 0.01 %)和正常对照组。分别培养24，48，72 h，到终止培养前4h，每孔加入MTT（5 μmol/L）20 μl，继续培养4h后终止培养，小心吸出孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震荡混合仪震荡10 min，使结晶充分溶解。选择490 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。 按公式计算抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。用IC50软件算出IC50值（细胞抑制率为50%时的药物浓度）。MTT实验证实OMSO＜0.01%，对细胞无抑制作用，以下各组实验均以DMSO组为对照组（OMSD＜0.01%）。
       2.3 细胞形态学观察以每孔2×104个/ml细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，空白对照组和冬凌草甲素4个剂量组分别加入浓度为0，5，10，20，40 μmol/L冬凌草甲素。72 h后在倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
       2.4 半定量RT-PCR检测相关基因的表达变化取经药物作用48 h后各实验组的MDA-MB-231细胞，按Trizol Reagent试剂盒说明书提取MDA-MB-231细胞总RNA，按照RT试剂盒（美国Fermentas公司）的说明操作，进行RT-PCR。引物设计借助引物设计软件Primer Premier 5.0 设计正义和反义引物。见表1。表1  RT-PCR引物序列（略）
       反应条件：Bcl-xl: 94℃ 3 min; 94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s，35个循环；结束前72℃延伸10 min。Bid: 94℃ 3 min; 94℃ 45 s, 56℃ 45 s, 72℃ 45 s，35个循环；结束前72℃延伸10 min。caspase-3: 94℃ 3 min; 94℃ 45 s, 50℃ 45 s, 72℃ 45 s , 35个循环；结束前72℃延伸10 min。
       2.5 流式细胞仪测凋亡选取40 μmol/L冬凌草甲素作用细胞48h，处理完毕后，常规消化，制成单细胞悬液，将约1×106个细胞移入离心管中，1 000 r/min，离心10 min，弃上清后，用PBS溶液洗涤两遍，在离心管中留约0.5 ml的PBS溶液，用吸管吹打使细胞悬浮，快速加入70%冷乙醇固定，4℃固定12 h以上。检测时，离心弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶Inil(pH值1.5～2.0)消化10 min，PBS溶液冲洗1次，采用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量荧光染色法，染液中含PI 50 mg/L，Triton X 100 1.0%。每份样品中加入DNA染液1.0 ml，4℃染色30 min，以500目筛网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，上机检测细胞凋亡率。
       2.6 统计学处理所有实验结果数据均用±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行处理，分析方法采用方差分析,以P﹤0.05为显著性差异。
       3 结果
       3.1 冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用表2 是冬凌草甲素(0～40 μmol /L) 作用于MDA-MB-231细胞24，48和72 h 后的抑制率,从表中可见冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞增殖具有较强抑制作用，且抑制作用在一定范围内有时间－剂量依赖性。冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞不同作用时间的IC50值为： 30.62 μmol/L（24 h），25.45 μmol/L（48 h），7.210 μmol/L（72 h）。表2  冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞抑制率的影响（略）
       3.2 显微镜观察细胞形态变化5～20 μmol/L冬凌草甲素作用72 h后在倒置显微镜下观察，可见部分细胞自瓶壁脱离、崩解死亡，悬浮与培养液中，部分胞体变细变小，部分细胞边界不清，胞浆内颗粒粗大，少数的细胞仍贴壁生长，残存细胞形态不规则，状态差，反光差(见图2，3，4)；40 μmol/L组细胞大部分死亡，出现大量细胞碎片(见图5)；而空白对照组细胞贴壁紧，形态规则，状态良好，反光强(见图1)。
       3.3 RT-PCR检测凋亡相关基因Bc1-xl、Bid、 caspase-3的表达变化GAPDH作为内参以保证在相等的mRNA含量下进行比较。与对照组相比，随着药物浓度的增高,冬凌草甲素能逐渐下调Bcl-xl基因表达，上调Bid和caspase-3基因表达。见图6，表3。表3  MDA-MB-231细胞 Bcl-xl、Bid和caspase-3 mRNA表达水平（略）
       3.4 流式法检测细胞凋亡本次实验中，40 μmol/L冬凌草甲素处理组与对照组相比，在流式细胞结果图上G1期峰的前方出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。流式细胞仪检测冬凌草甲素作用于MDA-MB-231 细胞48 h后,细胞凋亡率为75%。见图7～8 。
       4 讨论
        细胞凋亡是一个多基因参与的细胞死亡过程，从启动到完成受凋亡启动基因和凋亡抑制基因的严格调控。哺乳细胞凋亡主要包括两条途径，即死亡受体途径和线粒体途径。
       B细胞淋巴瘤基因-2(B-cell lymphoma-2，Bc1-2)家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键作用的一类蛋白质［3］。它通过与其它凋亡相关因子的协同作用调控着线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡主开关的作用［4］。Bcl-2家族成员按结构和功能的不同，分为两大类：Bcl-2类是凋亡抑制因子，包括Bcl-2、Bcl-xl等，Bax类是凋亡促进因子，包括Bax，Bak，Bid和Bad等。这两类物质相互结合、彼此抑制，依据其数量的相对多少决定凋亡的发生与否。Bax占优势时，细胞凋亡，Bcl-2占优势时，细胞凋亡受抑制。Bcl-xl 具有比Bcl-2更强的抗凋亡作用，且能不依赖于Bcl-2的表达而单独发挥抗凋亡作用。Bcl-xl与Apaf-l结合后可抑制Apaf-l与Caspase-9前体的结合，以此抑制Caspase-9的活化，从而抑制细胞凋亡［5］。
       
       Bid (BH3结构域凋亡诱导蛋白B，H3 interacting domain death agonist)是Bcl-2家族中的BH3-only蛋白成员，在细胞凋亡的线立体途径和死亡受体途径中起重要作用，是死亡受体途径和线粒体途径联系的纽带，通常在活细胞中Bid位于细胞质中，当细胞暴露于凋亡诱导因子如肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等的环境中，被激活的凋亡酶Caspase 8将Bid蛋白切割成两个片断，随后其C-端片段转移到线粒体上诱发细胞色素c的释放，最终引起细胞凋亡［6，7］ 。此外Bid还可以与线粒体胞质面Bcl-xl结合形成异二聚体阻止Bcl-xl和Apaf-l结合，抑制其抗凋亡活性。
       
       Caspase是1996年由Alnemri等统一命名的一类人源的ICE/Ced同源性半胱氨酸蛋白酶。参与细胞凋亡的Caspases可分为两大类。一类是启动子Caspases，包括caspase-8、 caspase-9、 caspase-10等，它们可与死亡信号转导通路中的分子结合，形成二聚体，而后通过自身催化而激活；另一类是效应子，包括caspase-3、 caspase-6、 caspase-7等，它们是启动子Caspases的下游酶，可被启动子Caspases激活，起凋亡执行者的作用。其中caspase-3家族起核心作用，直接参与介导细胞凋亡过程。目前认为，细胞中Caspase一经活化，凋亡即不可避免。
       
       有研究表明，冬凌草甲素诱导肿瘤细胞的凋亡作用与caspase途径有关。张春玲等［8］研究发现 caspase家族抑制剂,对冬凌草甲素诱导HeLa细胞的凋亡起不同程度的抑制作用；冬凌草甲素作用于HeLa 细胞后, caspase-3 的活性是明显增高。提示了冬凌草甲素诱导HeLa 细胞凋亡过程中激活了caspase 途径。本实验研究发现冬凌草甲素作用于MDA-MB-231细胞，随药物浓度的上升,Bcl-xl mRNA的表达逐渐下降，Bid 、caspase-3 mRNA的表达上调。由此可推断冬凌草甲素诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的过程有Bid 、Bcl-xl和caspase-3基因的参与，可能是通过抑制Bcl-xl的表达和增强bid的表达，而激活caspase-3，诱导细胞凋亡。
       
       凋亡细胞核内DNA由于受到内源性核酸内切酶的作用断裂成小片段DNA。在细胞固定过程中，细胞膜的通透性增加，这些小片段DNA部分游离出来，细胞内经荧光染料染色的染色体DNA可染性降低，故在流式细胞仪结果图上G1期峰的前方出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。张俊峰等［9］，研究冬凌草甲素对肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制作用发现24～32μmol/L的药物作用60 h后凋亡细胞数量达高峰(>50％)。本次实验中，冬凌草甲素处理组与对照组相比，出现了亚二倍体峰，凋亡率达75%，进一步说明冬凌草甲素有促进细胞凋亡的作用。
       【参考文献】
         　　［1］李瑞芳,王庆瑞. 冬凌草甲素对K562细胞端粒酶活性调控及细胞周期的影响［J］.药学学报,2004,39(11):865.
       
       ［2］Liu JJ, Wu XY. Anti-proliferation effect of oridonin on HL-60 cells and its mechanism［J］.Chin Med Sci J. 2004,19(2):134.
       
       ［3］Ji HB，Zhai QW．Transcription regulation of bcl-2 gene［J］．Acta Biochem Biophys Sin，2000，32(2)：95．
       
       ［4］Tsujimoto Y，Shimizu S．Bcl-2 family：Life or death switch［J］．FEBS lett，2000，466(1)：6.
       
       ［5］Kuwana, Newmeyer. Bcl-2-family proteins and the role of mitoch-ondria in apoptosis［J］.Current Opinion Cell Biology,2003,15(4):1.
       
       ［6］Terrones O, Antonsson B. Lipidic pore formation by the concerted action of proapoptotic BAX and Tbid［J］. J Biol Chem. 2004,16,279(29):30081.
       
       ［7］Van Mau N, Kajava AV. Interactions of Bax and tBid with lipid monolayers［J］. J Membr Biol,2005 ,2007(1):1.
       
       ［8］张春玲,吴立军,田代真一,等. 冬凌草甲素通过激活Caspase诱导HeLa细胞凋亡［J］.中国药理学通报,2003,19(5):521.
       
       ［9］张俊峰，陈规划，陆敏强 ，等．冬凌草甲素对人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制作用及其作用机制［J］． 中成药,2006,28(9):1325.