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       【关键词】  木瓜；,,水溶性；,,指纹图谱；,,高效液相色谱法
       摘要：目的研究不同采收时间和不同炮制方法的木瓜药材水溶性部位高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，为木瓜的规范化种植与合理应用提供依据。方法以绿原酸为参照物，采用HPLC法测定分析各指纹图谱，色谱条件：C18（Kromasil C18 10 nm~5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱,流动相: (A)乙腈甲醇（6：4）(B) 0. 05 %磷酸梯度洗脱，0～12 min (10%~30%A ,90%~70%B) ,12～30 min (30%～50%A,70%～50%B) ,30～35 min (50%～70%A,50 %～30%B) ,35～45 min (70%～90%A ,30%～10%B) ,45～50 min (90%～60%A ,10%～40%B) ,50～60 min(60%～10%A , 40%～90%B) , 60～70 min(10%A ,90%B)；流速0.8 ml・min 1 , 检测波长283 nm。结果木瓜水溶性部位的指纹图谱有较好的相关性。分析表明，木瓜不同采收时间的样品分为3类―第2，3，6，9批归为一类，有13，17，19 min3个，共有峰；第1，5，8批归为一类，出峰各有5个，有13，17，19 3个共有峰；第4，7归为一类，有17，19两个共有峰。其中又以第5批采收时间最好；不同炮制方法以晒的方法所含峰数目和含量要高；不同存放时间以存放时间短的较好。结论该研究有助于木瓜的质量控制、采集和应用。
       关键词：木瓜；  水溶性；  指纹图谱；  高效液相色谱法
       HPLC Fingerprint of WaterSoluble Part of Fruit of Chaenomeles
       HUANG Zhijun， TAO Junyan ， XIONG Fuliang， ZHANG Qiongguang， XIAO Fei， LI Chongming， ZHOU Zhongbo
 
　　(Wuhan Jianmin Pharmacy Group Limited Company, 430052, China; College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the HPLC fingerprint of  the watersoluble part of Fruit of Chaenomeles of different collected time and processed method, and to provide application and GAP basis for the herb.. MethodsHPLC with UV detector was used to analyze the patterns of  fruit of Chaenomeles. Chlorogenic acid  was used as standard substances, C18（Kromasil C18, 10 nm~5 μm，4.6 mm×250 mm）column was used with a mobile phase of (A) acetonitrilemethonal (6:4)(B) 0. 05 %phosphoric acid gradient elution , 0～12 min (10%~30%A, 90%~70%B) ,12～30 min (30%～50 %A ,70%～50%B) ,30～35 min (50%～70%A ,50%～30%B) ,35～45min (70%～90%A ,30%～10%B) ,45～50 min (90%～60%A ,10%～40%B) ,50～60 min(60%～10%A , 40 %～90 %B) , 50～60 min(10 %A ,90 %B)；The flow rate was 0.8 ml・min 1 ,The wavelength of detector was set at 283 nm.Results The fingerprint of fruit of Chaenomeles was set up and the fingerprint of them showed an excellent correlationship. ConclusionThe study is helpful for the quality control, the gathering and application of Chinese flowering quince.
       Key words：Fruit of Chaenomeles ;  Watersolubility ;  Fingerprint ;   HPLC
   
　　木瓜(Fruit of Chaenomeles，or Chinese quince)为蔷薇科植物皱皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果实，为常用中药［1，2］。本文主要对木瓜不同采收时间、不同炮制方法的水溶性部位进行了较为详细的研究。
       　　1  材料与仪器
       1.1  药材来源湖北省GAP种植基地不同采收时间：第1批至第9批分别是6月2日，6月12，6月22日，7月2日，7月12日，7月22日，8月2日，8月12日，8月22日。第1至第9批分别为晒制而采收时间不同的样品；其中第8批又分为晒制（8）和烫制（8＇）两种不同炮制方法；第9批分为新鲜晒制（9）和存放1年时间（9＇）两种。
       1.2  仪器与试剂仪器:DIONEX（P680HPLC PUMP，SOLVENT RACK SOR100）；试剂：乙腈、甲醇(色谱纯)、磷酸、醋酸乙酯(均为分析纯)，双重蒸馏水；咖啡酸、绿原酸对照品（购于中国药品生物制品检定所购于中国药品生物制品检定所，批号分别为：0885200001、0753200111）。
       　　2  方法与结果
       2.1  参照物溶液制备分别精密称取咖啡酸、绿原酸对照品适量，分别加甲醇制成每毫升含0.106 mg咖啡酸、0.492 mg绿原酸对照品溶液；然后分别精密吸取咖啡酸对照品溶液5 ml、绿原酸对照品溶液1 ml，加甲醇定容至25 ml，制成两种对照品的混合溶液。
       2.2  供试品溶液的制备［3~5］精密取药材粉末0.25 g于100 ml具塞锥形瓶中，精密吸取50 ml甲醇，称重，盖好瓶塞后超声提取45 min，称量，并用甲醇补足重量，放冷至室温，过滤，取续滤液，然后用0.45 μm微孔滤膜过滤，制得水溶性溶液。
       2.3  色谱分析条件［6~9］C18（Kromasil C18 10 nm~5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱,流动相: (A) 乙腈甲醇（6∶4）(B) 0.05%磷酸梯度洗脱，0～12 min (10%～30%A, 90%～70%B),12～30 min (30%～50%A,70%～50%B),30～35 min(50%～70%A,50%～30%B),35～45 min (70%～90%A,30%B～10%B),45～50 min(90%～60%A,10%～40%B),50～60 min(60%～10%A , 40%～90%B), 60～70 min(10%A,90%B)；流速0.8 ml・min 1  , 检测波长283 nm。所有组分均在60 min之内洗脱出柱。结果见图1～3。
       3、4依次为绿原酸、咖啡酸
       图1  3种对照品溶液、空白溶剂的HPLC（略）
       图2  木瓜采收第1批药材水溶性成分HPLC指纹图谱（全图）（略）
       2.4  系统适用性实验与精密度考察
       2.4.1  精密度实验取同一供试品溶液，连续进样5次，计算出峰时间和峰面积的精密度，结果表明各峰出峰时间的精密度在0.05%~0.75％之内，出峰面积的精密度在0.35%~2.0％之内，实验表明精密度良好。
       2.4.2  稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24  h进样，计算各峰的保留时间和峰面积（以绿原酸为1，因为绿原酸在其中峰面积最大）。结果显示供试品溶液的指纹图谱在24 h内稳定，各峰相对保留时间的RSD在0.25%~1.46％内，相对峰面积的RSD在0.57%~1.86％内。
       2.4.3  重现性实验［10］取同一批号药材粉末5份，照前述处理方法制得供试品溶液，分别进样测定。实验表明本法重现性良好。
       2.5  不同采收时间、不同炮制方法、市售和新鲜药材HPLC指纹图谱的建立取不同采收时间、不同炮制方法、市售和新鲜药材，分别按上述2. 2 方法制备供试品溶液，进样并记录指纹图谱。结果见图4~6 。
       图3   木瓜采收第1批药材的HPLC指纹图谱（局部图）（略）
       指纹图谱1，2，3，4，5，6，7，8，9（自下向上）依次为木瓜采收第1，2，3，4，5，6，7，8，9次晒制样品
       图4  木瓜不同采收季节以及不同炮制方法样品水溶性HPLC（略）
       1.第8批烫制样品；  2.第8批晒制样品
       图5  木瓜不同炮制方法比较图（略）
       1.第9批存放1年的晒制样品；  2.第9批新鲜晒制样品
       图6  木瓜不同存放时间比较图（略）
       3  讨论
       从指纹图谱共有峰的峰位和峰形看，11个样本较为相似。说明该指纹图谱具有一定的特征性，基本能反映木瓜药材的特征。但是，来自不同采收时间、不同炮制方法、不同存放时间样本的非共有峰和各峰峰面积存在着明显差异，说明不同来源样本所含的化学成分及其含量有明显不同。采收时间：第5号样本，即采收的第5批药材峰数最多、特征峰的峰面积最大，因此木瓜采收时间应选用第5批的采收时间7月12日。炮制方法：晒制方法比烫制方法的药材峰数多、特征峰的峰面积大。因此药材应采用晒的方法。存放时间：对药材而言，新鲜药材的成分要比存放1年时间药材的成分含量高，说明存放时间对药物成分含量也有一定影响。
       3.1  共有峰与非共有峰的标定［10］
       3.1.1  共有峰综合比较，11个样本具有2个共有峰：17.339 min（绿原酸）、19.796 min（咖啡酸）；另外还有很多批含有13.257 min的峰。30 min之后和7~10 min内的峰为溶剂峰。
       3.1.2  非共有峰标定从色谱图可知，第1批药材中非共有峰保留时间是12.635，14.287，15.158 min，第5药材中非共有峰保留时间是15.34，16.88，22.79 min，第8批药材中非共有峰保留时间是20.75，21.19 min，第2，3，4，6，7，9批药材无非共有峰。
       3.1.3  聚类分析对采收时间不同的9批药材HPLC指纹图谱中各特征峰相对峰面积（以绿原酸为对照峰进行计算）进行聚类分析（以夹角余弦为测度），利用Excel软件,分别采用相关系数和夹角余弦作测度。结果见表1，聚类分析结果见图7。
       表1  不同采收时间木瓜聚类分析（略）
       图7  聚类分析图（略）
       通过聚类分析以及上述共有峰、非共有峰的比较，以出峰多少为比较基础，11批药材可以分为3类第2，3，6，9，9批为一类，有13，17，19 min 3个共有峰；第1，5，8，8/批为一类，出峰各有5个，并有13，17，19 min 3个共有峰；第4，7批为一类，有17，19 min两个共有峰。从上述聚类分析看，5，6，7采集时间较好，其中又以第5批为最佳采集时间。其他采集时间不是很好。
       3.2  提取方法采用60％乙醇、乙醇、甲醇、水4种不同溶剂，对提取时间、提取次数、药材粒径进行了正交实验，同时对甲醇超声提取（提取时间、提取溶剂）进行了优化实验，最终选择上述供试品制备方法。
       3.3  参照物选择实验初期，我们选择了绿原酸、咖啡酸、齐墩果酸3种标准混合物（如图），后通过对比药材图谱，选用绿原酸、咖啡酸为对照品即可（因为图谱中此波长齐墩果酸没有吸收，咖啡酸含量很低，故仅选择绿原酸为对照品）。
       3.4  色谱条件选择本实验试图采用醋酸乙酯部位的色谱条件（另文发表），结果发现分离情况很差，因此做了相应修改，取得了较好的分离效果。
       3.5  水溶性成分与中等极性成分比较甲醇和醋酸乙酯提取的主要成分很相似，但甲醇提取物的峰相对要多一些。通过本实验，对木瓜药材的控制有了一个比较明确的定量和定性标准，便于药材的规范化种植。但是由于木瓜资源多样性以及采集时间差异性，导致测定结果变化较大，同时试验设计还需要更全面考虑，如制备样品的方法、药材资源还应该更广泛、实验中出现炮制方法、存放时间引起的变化由于样本数量影响还不能明确结论，另外，这些变化的原因也值得进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  中国医学科学院药物研究所．中药志，第3册，第2版［M］.北京：人民卫生出版杜，1993：215.
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       基金项目：国家“十五”科技攻关项目（No.2001BA701A6012)
       （武汉健民药业集团股份有限公司，湖北 武汉  430052；华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 湖北  430074）