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       【摘要】 
       通过分析原发性肝癌的蛋白质组学研究现状及肝癌中医辨证分型研究，探讨应用蛋白质组学技术研究肝癌中医证型的可行性及方法，给传统证候研究带来新的契机。
       【关键词】  原发性肝癌 蛋白质组学 证候
       随着现代医学的发展，人类基因组计划的完成，标志着人类基因研究进入了一个新的阶段，但基因组DNA序列并不能完全反映这些信息，不足以描述整个生命活动，深入研究基因功能的执行者——蛋白质显得十分必要，蛋白质组学是应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科。原发性肝癌的发生是一个多环节、多因素的复杂过程，在分子水平有不同的功能性蛋白的参与，若能为肝癌的辨证分型提供现代医学生物学依据，将对“证”的半定量化、定量化及客观化、标准化，建立西医微观指标与中医证候的联系，探索“证”的实质。本文就运用蛋白质组学研究原发性肝癌中医证型作一初步探讨。
       1  原发性肝癌的蛋白质组学研究
       目前原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，我国年发病人数约35万，每年约32万人死于此病，新患肿瘤病人中55％发生在中国［1,2］，严重威胁着人们的健康及生命，现已成为我国第二位恶性肿瘤致死原因［3］。目前大多数肝癌诊断时已经是晚期，预后差，中位生存期仅为6个月，3年生存率仅为5.1%，5年生存期为0［4］。
       
       “蛋白质组”这一概念是由澳大利亚的Wilkins和Willians于1994年提出，目前定义为一个基因组所表达的全部蛋白质［5］。蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，是专门研究细胞内全部蛋白的动态表达, 是对基因组所表达的整套蛋白质的分析，是真正的对基因的功能(或称结果)进行研究的一门科学，与基因组的均一性相比,蛋白质组则具有多样性。从功能水平看，肿瘤是一种蛋白质组疾病。深入研究肝癌患者的蛋白质谱的变化，对揭示和发现肝癌发生、发展的规律有重要意义。
       
       目前有学者运用蛋白质组学技术从细胞、组织、血清等方面对肝癌进行了深入研究。Yokoo H［6］等发现9株分泌甲胎蛋白的HCC细胞株与不分泌AFP的7株HCC细胞株相比，有6种蛋白表达上调，5种蛋白表达下调，质谱分析显示这11种蛋白与细胞凋亡、糖代谢、细胞骨架构成及蛋白质翻译有关，而凋亡、糖代谢等的异常均与HCC发生有关。
       Li等［7］用双向电泳的方法和质谱技术分析鉴定肝癌组织和癌旁组织之间的差异蛋白，发现80个点，其中包括Stathmin 1，PCNA， Heat shock 27 kD等与肿瘤细胞增殖相关的蛋白。Song等［8］应用蛋白组学研究方法双向电泳和质谱技术分析鉴定有转移和无转移HCC原发灶组织间的差异表达蛋白，初步鉴定出16个蛋白，包括热休克蛋白27、角化蛋白28、S100钙结合蛋白A10等。
       
       Lee等［9］检测肝细胞癌、慢性肝病和健康人的血清，发现分子质量8920的蛋白质峰与HCV感染密切相关，在HCV阳性的慢性肝病患者及肝细胞癌患者中表达均明显上调，与HBV感染组、健康人中的表达存在显著差异，经鉴定这个8920的蛋白质为补体C3a，该补体有可能作为一种独立的生物标志物，在诊断HCV感染的慢性肝病和肝细胞癌患者的过程中发挥作用。黄成等［10,11］在研究中发现，门静脉癌栓、肿瘤大小、肿瘤数目是影响肝细胞癌患者血清蛋白质指纹图谱的重要因素，而性别、肝硬化、AFP等对血清蛋白质指纹图谱没有明显影响；肿瘤大小以5cm分界对血清蛋白质指纹图谱影响最大；门静脉肉眼癌栓对血清蛋白质指纹图谱影响明显大于镜下癌栓，其中筛选出的16个蛋白分子标记物可能与肝细胞癌门静脉癌栓形成有关。
       
       一个基因并不只表达一种蛋白质，遗传的差异性使得蛋白质的表达差异很大，出现个体差异，因为蛋白质组反应了细胞内在的遗传程序和直接的环境影响。即在同一生物个体的在肿瘤研究方而，蛋白质组学技术可揭示肿瘤蛋白表达水平的变化与肿瘤发生发展不同阶段的关系，有助于肿瘤的诊断和治疗，将成为寻找疾病分子标记和药物靶点的方法之一。蛋白质组学对于机体、组织或细胞全部蛋白质表达和功能进行研究的思路与中医证候认识疾病的整体观、辨证观有着趋同性。通过对差异个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，蛋白质组学方法在证候研究中的合理应用,应该会给传统证候研究带来新的契机。
       2 肝癌中医辨证分型研究现状
       由于中晚期肝癌的治疗效果不理想，中医药参与原发性肝癌的多学科综合治疗模式逐渐成为临床疗效提高的关键及肝癌临床研究的热点之一。尽管近年中医药对肝癌的研究取得了较大的进展，具有缓解临床症状，改善生存质量，延长生存期及配合放化疗减毒增效的作用。但仍存在着辨证分型不规范、辨证分型难以体现肝癌自身独有的特点、缺乏流行病学研究等缺点。鉴于目前肝癌患者仍缺乏有效的治疗方法及药物，如何使中医辨证论治规范化，提高辨证论治的准确度，成为近年来肝癌领域研究的重要课题。
       由于肝癌发病的不同部位，疾病所处阶段不同，患者体质不同、地理气候环境不同，故临床辨证分型的标准不同，目前国内尚无统一意见。张效霞等［12］认为，健脾理气法是治疗肝癌的有效方法，将原发性肝癌辨为脾虚气滞、湿热阻滞、脾虚水泛、淤血内停四型，分别选用不同的健脾理气药。熊墨年［13］将30例原发性肝癌患者分为4个证型,分别为肝郁脾虚型、气滞血淤型、肝胆湿热型、正虚淤结型，给予相应的中医辨证治疗，结果6个月生存率为46.6%；1，2，3，5年生存分别率为25.5%，16.56%，11.04%，7.36%30例患者经中医辨证治疗后，在缓解肝区疼痛、退热、增进食量等方面有明显疗效。
       
       由于没有统一的辨证分型标准，相关学者从文献进行统计学分析归纳，对于肝癌的证型研究基础具有重要的指导和借鉴意义。李永健等［14］统计近 20 年来国内外公开报道的肝癌辨证分型, 结果发现肝癌最常见的证型依次为肝胆湿热型、湿热内蕴型、气滞血淤 型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、肝郁气滞型、脾胃虚型, 而肝胆湿热型、湿热内蕴型亦为肝癌证型中常见证型。潘敏求等［15］收录了建国以来的253篇中医药治疗中晚期原发性肝癌的主要临床文献，采用频数和排序等统计分析，结果表明气滞血淤 、湿热聚毒、脾虚湿困、肝气郁结和肝肾阴虚等常见证候的频率为79.07％。
       
       亦有学者将实验室指标与肝癌证型进行相关性研究，林丽珠等［16］关于原发性肝癌辨证分型与肝功能及肝储备功能关系的研究结果:AST肝盛脾虚型稍低,肝热血淤 型次之,肝肾阴虚型最高；ALB则以肝肾阴虚型最低,肝热血淤 型次之,肝盛脾虚型稍好；而TBIL以肝热血淤型最低,次之为肝盛脾虚型,肝肾阴虚型最高。周小梅等［17］通过对肝癌常见证型气虚血淤与气滞血淤证T细胞亚群进行比较,气虚血淤证患者CD3,CD4,CD4/CD8下降和CD8升高较气滞血淤证明显,说明肿瘤患者气虚血淤证的免疫功能低下情况比气滞血淤证严重，也就是说出现脾气虚时免疫功能异常。燕忠生等［18］研究原发性肝癌中医证型临床特点与预后关系研究，发现肝肾阴虚型患者较其它三型肿瘤转移率显著高,K氏评分显著降低；肝郁脾虚、气滞血淤 型患者一般病情较轻,愈后较好,生存期较长,而湿热毒淤 型、肝肾阴虚型则病情较重,愈后差,生存期短。这些资料为本研究对中医辨证与实验室检查、生存质量、生存期的相关性分析提供了理论依据，但仍存在着研究深度不够，缺乏多层次、多视角的系统动态研究。
       3 应用蛋白质组学技术研究肝癌中医证型的探讨
        辨证论治是中医的理论核心，中医“证”是疾病发生过程中不同阶段病因病机的高度概括，其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群。辨证施治既不同于对症治疗，也不同于西医的辨病治疗。辨证是司外揣内，在具体运用上受到医患双方主观因素的影响，难以客观化和量化，所以必须通过“证”的内涵研究。既然同一证有共同的临床表达和病理机制，那么其肯定有共同的物质基础，而这种物质基础就很有可能反映在基因或基因组水平上。
       
       蛋白质组学属于微观实验研究,但其动态、宏观、整体和综合特点与中医证候具有的波动性、整体性、时序性、可预测性和标志性极其相似。蛋白质组研究的差异蛋白质在数量、种类和含量上的差异,可能为证候的多样性、时空性、个体差异性的标志蛋白群的特征；证候的多变性和复杂性与蛋白质组的动态性和多态性概念相吻合。通过证候的蛋白质组学研究, 通过对某一病证相关特定组分的共性加以分析、判断，能够帮助人们更好地理解病变过程，有助于疾病的生物标记物的发现而达到辅助临床诊断的目的，有可能较全面地揭示证候的微观状态,为证候的诊疗提供支持，因此在通过蛋白质组学技术研究肝癌中医证候具有一定的可行性。
       目前，在蛋白质组学研究的方法上，二维电泳－质谱、双向凝胶电泳、质谱鉴定技术、蛋白质芯片等为有效的技术平台，为了从“辨基因治疗”到“辨证治疗”中找出相关性，可以应用蛋白质学技术和方法研究肝癌中医证型间的差异，如在不同证型人群中提取组织或血清，利用双向凝胶电泳技术分离蛋白质，进行质谱分析，获得肽指纹图谱，通过蛋白质数据库来鉴定相关蛋白质，找出差异蛋白质谱，分析功能蛋白质差异表达的特征，从而在分子生物学水平找出不同肝癌证型间微观表达差异；或者是通过比较健康人与肝癌患者、亚临床肝癌患者同一证型的差异蛋白质谱表达，找出典型证型的微观特异性；亦或以蛋白芯片技术结合组织芯片技术，研究同一组织中成千上万个蛋白分子的变化情况，进行生物信息学和统计学的比较分析，从整体上比较肝癌不同证型间的蛋白质图谱差异，探索蛋白质表达图谱与肝癌中医各证型之间系统的、有规律的联系，建立肝癌证型特定的蛋白质数据库，从而为肝癌的证型诊断提供依据和方法。
       目前蛋白质组学技术在恶性肿瘤的中医药研究中鲜有报道，随着蛋白质组学方法技术的不断成熟，相信对中医证候的本质研究将进入更加深入、全面的阶段，为探索“证”的本质开辟一个崭新的局面。
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