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       【关键词】  青蒿琥酯；,,大鼠；,,关节炎；,,凋亡
       摘要：目的观察青蒿琥酯对佐剂性关节炎滑膜组织中凋亡因子Fas/FasL及Bcl2/Bax表达的影响。方法雄性Wistar大鼠60只随机分为6组，空白组、模型组（对照组）、青蒿琥酯I组（高剂量组）、青蒿琥酯Ⅱ组（低剂量组）、青蒿琥酯加甲氨喋呤组及甲氨喋呤组。除空白组外，各实验组用完全弗氏佐剂制备成佐剂性关节炎模型。记录用药干预后各组关节肿胀指数，免疫组化法检测滑膜组织中凋亡相关因子Fas/FasL，Bcl2及Bax的表达情况。结果 各实验组关节肿胀指数明显降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。滑膜组织中Fas/FasL及Bax被上调，Bcl2被下调，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 实验证实了青蒿琥酯有诱导佐剂性关节炎病情缓解的作用，上调滑膜组织中Fas/FasL及Bax，下调Bcl2的表达而诱导滑膜细胞凋亡可能是其机制之一。
       关键词：青蒿琥酯；  大鼠；  关节炎；  凋亡
       The Experimental Research on the Expression of Fas/FasL and Bcl2/Bax Correlated with Apoptosis in Synoviocyte of Adjuvant Arthritis with Artesunate
       CHEN Xianguo， SONG Xingfu，  CUI Xiangjun*， PAN  Lei， HOU Xiaoqiang
 
　　(The First College of Clinical Medical Science, China Three Gorges University, Yichang, Hubei 443003 China; Yichang Central People"s Hospital, Yichang, Hubei 443000 China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the expression of Fas/FasL and Bcl2/Bax  correlated with apoptosis in synoviocyte of adjuvant arthritis (AA) with artesunate. MethodsSixty wistar rats were randomly divided into six groups:normal group, model control group, artesunate group I(high dose), artesunate group II(low dose), artesunate plus MTX group, MTX group. Each group was modeled to adjuvant arthritis with complete Freund"s. After treated with artesunate or artesunate plus MTX, the arthrosis  index(AI), the expression of Fas/FasL，Bcl2，Bax, which were correlated with apoptosis in arthrosis synovial membrane tissue were examined by immunohisto chemistry(IHC). ResultsCompared with the model control group, the AI in every experiment group decreased significantly(P<0.01).  Compared with the model control group, the expression of Fas/FasL，Bax in arthrosis synovial membrane tissue increased significantly(P<0.05), Bcl2 decreased significantly(P<0.05). ConclusionThe effect of artesunate on the alleviation of adjuvant arthritis(AA) was proved in experiment, inducing apoptosis in synoviocyte was likely one of mechanisms.
       Key words：Artesunate;  Rats;  Arthritis;  Apoptosis
   
　　青蒿琥酯（artesunate）是青蒿素的衍生物之一，为我国自主知识产权的高效抗疟药，有学者将其试用于治疗红斑狼疮等结缔组织疾病取得了较好的疗效［1］，为了探讨青蒿琥酯对类风湿关节炎的作用，作者作了青蒿琥酯对佐剂性关节炎的药理作用、以及对佐剂性关节炎滑膜组织中凋亡因子Fas/FasL及Bcl2/Bax表达影响的实验观察，报道如下。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物与分组  雄性Wistar大鼠60只，平均体重：(150.23±20.56)g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。随机分为6组：空白组（8只），对照组（模型组）（8只），青蒿琥酯I组（10只），青蒿琥酯 II组（8只），青蒿琥酯加甲氨喋呤组（简称青加甲组，8只），甲氨喋呤组（8只）。
       1.2  药品、试剂及仪器  完全Freud佐剂,美国SIGMA公司 093K8932;青蒿琥酯注射液，桂林南药股份有限公司;兔抗鼠Fas(SC716)、兔抗鼠FasL多抗(SC834)、山羊抗小鼠IgG抗体HRP多聚体、兔抗鼠P53（M3566）多抗、Bcl2（sc7382）多抗、兔抗鼠Bax（sc7480）多抗以及ABC复合物试剂盒和DAB显色试剂盒均为美国Santa Cruz公司产品；甲氨喋呤，上海华联制药有限公司；德国Leica生物应用显微镜及图象分析系统；德国Leica切片机。
       1.3  方法
       1.3.1  造模及给药方法模型构建方法参阅文献［2］：除空白组外，余6组每只右足跖处注射0.1 ml完全Freud佐剂，致炎成佐剂性关节炎（AA）模型，空白组注射生理盐水0.1 ml。致炎后第13天开始给药，青蒿琥酯I组、青蒿琥酯 II组每天分别按40，20 mg/kg的剂量腹腔注射青蒿琥酯注射液，青加甲组每天按20 mg/kg的剂量腹腔注射青蒿琥酯注射液，每3天按0.4 mg/kg的剂量腹腔注射甲氨喋呤注射液。甲氨喋呤组每3天按0.4 mg/kg的剂量腹腔注射甲氨喋呤注射液。模型对照组每天腹腔注射生理盐水1 ml/只。共给药12 d。
       1.3.2  检测方法关节肿胀指数：计算标准［3］如下：0分，无红肿；1分，小趾关节红肿；2分，趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节以内的全部足爪肿胀。把各个关节的指数累积计分，即为每只大鼠的关节指数。标本采集及处理：给药的第13天处死大鼠，采集膝关节滑膜组织， 10%甲醛液固定，10%EDTA脱钙，梯度酒精脱水，正丁醇透明，石蜡包埋切片备用。免疫组化法检测滑膜组织中Fas/FasL、Bcl2及Bax的表达：ABC染色，常规脱蜡至水，微波修复，0.3%H2O2室温处理10 min，PBS液洗3次，除去PBS液，加1滴5%阻断血清，室温10 min，甩去多余液体，倾去血清，加1滴一抗，4℃冰箱过夜，PBS洗3次，除去PBS液，加1滴生物素标记的二抗，37℃，30 min，PBS洗3次，除去PBS液，加1滴AB酶试剂，PBS洗3次，除去PBS液，加1滴DAB显色剂显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。
       1.3.3  结果判断标准Fas／FasL，蛋白阳性为细胞浆出现棕黄色颗粒，根据平均阳性细胞数的计数结果分为4级，阳性细胞数在20%~30%的为+，31%~40%++，40%以上+++，以平均阳性细胞数（<20%为阴性表达〉20%为阳性表达［4］；Bcl2/Bax，判定标准［5］，阳性细胞为胞浆或胞膜棕黄色染色，阳性表达程度分三级，低倍镜野阳性细胞少于1/3为+、1/3～2/3++、大于2/3+++。
       1.3.4  统计学方法 实验结果用SPSS10.0软件处理。等级资料采用多个独立样本KruskalWallis秩和检验。
       　　2  结果
       2.1  造模效果至炎后18 h模型足开始肿胀，第6天各关节肿胀达到高峰，然后肿胀稍缓解，第12天后肿胀开始加重，造模第13天（给药前）模型组及各实验组关节肿胀指数明显高于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)，第26天（给药后）模型组明显高于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。表明造模成功。
       2.2  用药后对关节肿胀指数的影响 给药后第13天，各实验组关节肿胀指数明显低于给药前，差异有统计学意义（P<0.01），各实验组关节肿胀指数均明显低于对照组（模型组），差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
       表1  青蒿琥酯对佐剂性关节炎大鼠关节肿胀指数的影响（略）
       t值及P值为各组给药前后比较值
       2.3  对凋亡因子在滑膜组织中表达的影响
       2.3.1  滑膜组织中Fas/FasL的表达青蒿琥酯I组、青蒿琥酯II组和青加甲组滑膜组织中FasL上调，与对照组（模型组）比较差异有统计学意义（P<0.01），甲氨喋呤组与对照组（模型组）比较差异也有统计学意义（P<0.05）。青蒿琥酯I组和青蒿琥酯II组滑膜组织中Fas上调，与对照组（模型组）比较差异有统计学意义（P<0.05），青加甲组与对照组（模型组）比较差异有统计学意义（P<0.05），甲氨喋呤组与对照组（模型组）比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
       表2  青蒿琥酯对佐剂性关节炎滑膜组织Fas/FasL表达的影响（略）
       U值及P值为各实验组和模型组（对照组）的比较值
       2.3.2  滑膜组织中Bcl2及Bax蛋白的表达青蒿琥酯I组Bcl2表达下调，Bax上调，与对照组（模型组）比较，差异有统计学意义（P<0.05）；青蒿琥酯II组Bcl2表达下调，Bax上调，与对照组（模型组）比较，差异有统计学意义（P<0.05）；青加甲组Bcl2表达下调，与对照组（模型组）比较，差异有统计学意义（P<0.05），Bax上调，与对照组（模型组）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。甲氨喋呤组Bcl2表达下调，Bax上调，与对照组（模型组）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。
       表3  青蒿琥酯对佐剂性关节炎滑膜组织中Bcl2/Bax表达的影响（略）
       U值及P值为各实验组和模型组（对照组）的比较值
       40倍 免疫组化ABC染色 Bax      40倍 免疫组化ABC染色 Bcl2      40倍 免疫组化ABC染色 Fas      40倍 免疫组化ABC染色 FasL
       图1  切面图（略）
       　　3  讨论
       青蒿琥酯是青蒿素的衍生物之一，为我国自主知识产权药品，具有高效速效抗疟作用。其对以系统性损害为主要临床特征的结缔组织疾病的作用及机理已有较多的报道，如系统性红斑狼疮［1］，但其对以关节损伤为主要临床特征的结缔组织疾病，如类风湿关节炎的作用及机理的研究，尚鲜见报道。本文的目的是证实青蒿琥酯诱导佐剂性关节炎病情缓解的药理作用，并探讨其对佐剂性关节炎滑膜组织中凋亡因子的影响。完全弗氏佐剂诱导的佐剂性关节炎与类风湿关节炎有许多相同的组织学和免疫学特征［6］，是建立较早且比较成熟的类风湿关节炎实验动物模型。我们的实验是在成功的建立佐剂性关节炎模型的基础上进行的。实验表明，用青蒿琥酯干预后，各实验组关节肿胀指数明显降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。说明青蒿琥酯可缓解佐剂性关节炎病情。类风湿关节炎（RA）的发病与细胞凋亡过程异常密切相关，其滑膜细胞过度增生源于滑膜细胞凋亡的相对不足，诱导滑膜细胞凋亡对治疗类风湿关节炎有积极意义［7］，而青蒿素及其衍生物可诱导多种细胞凋亡［8］。本实验表明，青蒿琥酯可上调滑膜组织中Fas/FasL及Bax、下调Bcl2的表达，Fas是细胞表面的蛋白受体分子，分布于多种组织细胞，细胞表面的Fas可通过与它的天然配体FasL结合诱导细胞凋亡［9］。在细胞编程死亡中，Bcl2起着延缓细胞凋亡的作用［10］,Bax基因与Bcl2有40%的同源性，但作用完全相反，起着加速细胞凋亡的作用［11］。本实验提示青蒿琥酯对佐剂性关节炎的作用可能与通过这些因素诱导滑膜细胞凋亡有关，但是否能找到其诱导滑膜细胞凋亡的直接证据，有待进一步实验观察。
       　参考文献：
       ［1］  钟嘉煦，刘亚敏，刘红娇，等．青蒿琥酯治疗系统性红斑狼疮的安全性观察［J］.中药新药与临床药理，2000，11(6)：336．
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       ［10］  Tusjimoto Y，Croce M.Analysis of the structure，transtips，and protein products of Bcl2，the gene involved in human follicular lymphoma［J］.Proc Natl Acad Sci Usa，1986，183(5)：214.
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　　基金项目：湖北省卫生厅科研基金资助项目（No.0JX2B88）
       (三峡大学第一临床医学院，湖北 宜昌  443003；湖北省宜昌市中心人民医院  443000)