文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的寻找川芎的高效分子标记。方法以四川崇州都江堰、新都3个产地的川芎为材料，应用100 条简单序列重复间区多态性（ISSR）引物、64对扩增片段长度多态性（AFLP）引物对30个川芎个体进行多态性筛选。结果筛选到简单序列重复间区多态性特异性引物共10 条，扩增片段长度多态性特异性引物共6对；分别扩增出106和256条条带，多态条带百分率分别为22.64%和 22.27%。平均标记指数AFLP 的检测效率(1.78)明显高于ISSR(0.42)。两种标记基于遗传相似值聚类分析结果存在着一定的差异,但用Mantel测试对两种方法检测的遗传一致度进行相关性分析表明,它们之间存在着显著的相关性( r=0.6975，p=0.014)。结论川芎具有较低的遗传多样性，AFLP更有效于ISSR。
       【关键词】  川芎 简单序列重复间区多态性 扩增片段长度多态性
       川芎Ligusticum chuanxiong Hort.为伞形科藁本属的多年生植物，是著名传统中药材。以根茎供药用，具有活血行气，祛风止痛的功效，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、胸肋刺痛、头痛、风湿痹痛等［1］。在中国普遍分布在四川、江西、云南、吉林、甘肃、贵州、江苏等省。四川为川芎道地产区［2］，川芎已有一千五百多年栽种的历史。长期的自然选择和人工选择使不同产地的川芎从外部形态到有效成分的组成及含量上均存在一定差异［3］。但目前有关川芎的研究大多集中在药用成分分析，药理作用等方面［3，4］，遗传多样性研究几乎是空白。因此，寻找高效率鉴定川芎不同种质资源的有效分子标记技术方法具有重要意义。
       
       简单序列重复间区多态性 (ISSR)和 扩增片段长度多态性(AFL P)这两种分子标记方法已在遗传群体结构分析、亲缘关系分析以及基因图谱构建等方面得到了应用［5～8］。ISSR与AFLP标记均具有无需预先知道受试基因组DNA序列, DNA用量少,灵敏度高,对反应条件不敏感,重复性好,能提供丰富的关于基因组的信息等优点, 一般而言, AFLP具有更高的灵敏度,能检测出更高的遗传多样性,但所需仪器和药品价格昂贵,实验成本高,检测过程繁琐；ISSR分子标记技术具有操作简单、实验成本低的优点，但灵敏度不高。选择合适的分子标记对能否客观反映研究对象的状况具有重要的影响［9］ 。本研究对ISSR和AFLP 两种分子标记方法进行了比较研究, 旨在寻找适合川芎的高效分子标记, 以期为川芎的真伪辨别、遗传育种及种质资源的保护和合理利用提供科学依据。
       1 材料
       30个川芎样品采自四川崇州(编号1～10)、都江堰(编号11～20)、新都(编号21～30)，每样株间隔距离至少5 m以上，每株采集的叶片迅速装入自封袋中用硅胶干燥保存，并尽快进行总基因组DNA的提取。
       2 方法
       2.1 基因组DNA的提取采用CTAB,并进行改良［10］。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度仪测定DNA浓度。
       2.2  ISSR扩增及检测ISSR引物(UBC set No.9) 由加拿大哥伦比亚大学提供。从100条引物筛选出扩增条带清晰、重复性较好的引物用于PCR扩增。ISSR反应体系为 25 μl,包括2 μl DNA模板( 25 ng/μl ) 、0.5 μl引物( 1 mmol/L)、5 μl dNTP (1 mmol/L)、2 μl 10 ×PCR buffer，1 U rTaq DNA聚合酶和14.5 μl ddH2O。dNTP，rTaq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司;扩增反应在PTC100TM(Programmable Thermal Con2troller, MJ Research Inc ,美国) PCR扩增仪上进行; PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，48～52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min,共计45个循环; 72 ℃延伸7 min; 4 ℃ 10 min终止反应;扩增反应结束后,用2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE) ,电压80 V,电泳时间30 min,然后用EB染色,凝胶成像系统照相,观察扩增结果。
       2.3 AFLP扩增及检测接头与引物按照文献［11］提供的序列,由北京赛百盛公司合成。从选择性引物中筛选出条带清晰、反应稳定的引物组合进行AFLP分析; AFLP反应参照文献［12］进行。取400 ng总DNA用EcoRⅠ (Biolabs)和MseⅠ(Biolabs)双酶切,酶切产物用T4 - 连接酶( TaKaRa)与接头连接;然后用无选择性碱基的引物进行预扩增,预扩增程序为:94 ℃变性2 min, 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环后, 72 ℃延伸5 min, PCR反应结束后,置4 ℃保存。取10 μl预扩增产物0.1×TE稀释10倍,作为选择性扩增反应模板;选择性扩增采用“Touch down”策略。反应程序为: 94 ℃变性2 min, 94 ℃变性30 s, 65 ℃退火30 s (每个循环降低0. 7 ℃) , 72 ℃延伸1 min,共12个循环; 94 ℃变性30s, 55.5℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min,在进行23个循环后, 72 ℃延伸5 min， PCR反应结束后，置4 ℃保存；5 μl选择性扩增产物样品加入等体积甲酰胺染液在95 ℃加热5 min后立即在冰浴中冷却。以100 bp Ladder marker作参照，用6%的变性聚丙烯酰胺胶,70 W预电泳45 min，上样后75 W电泳70 min；银染,照相,观察扩增结果。
       2.4 数据分析将ISSR，AFLP扩增产物每个条带均视为一个分子标记(maker)，代表一个引物的结合位点。按凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计，有带(包括弱带)的记为“1”，无带的记为“0”的格式分别输入构成的ISSR表型和AFLP表型数据矩阵用于进一步的分析。应用POPGENE1. 32软件对30个个体进行遗传参数分析,计算多态位点百分率( PPB, percentage of polymorphic bands) 、观测等位基因数(Na , Observed number of alleles ) 、有效等位基因数(Ne , Effective number of alleles) 、Nei基因多样性(H,Nei′s gene diversity) , Shannon信息指数( I, Shannon′s Information index) 、Nei遗传距离(1978) (genetic distance)与遗传一致度(genetic identity)等参数。并计算评价分子标记效率参数［13］：有效多态率（Effective multiplex ratio，E）和标记指数(marker index ，MI)。E = n × PPB(n为每对平均引物扩增的条带数)；MI = E × H。用NTSYS-pc Version 2.10e 软件进行UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic average,非加权配对算术平均法)聚类分析，得到30个样品的聚类树状图。用TFPGA软件的Mantel检验软件检测这两种标记的相关性。
       3 结果
       3.1 ISSR与AFLP的多态性效率比较利用合成的100条ISSR引物对30个川芎进行PCR 扩增，初步筛选10条引物(见表1)。这10条ISSR引物共产生了106条扩增条带(150～2 700 bp),其中24条是多态性的(见图1)。利用合成的64对AFLP随机引物对30个川芎进行PCR 扩增, 初步筛选6对引物(见表2)。这6对AFLP引物共产生了256条扩增条带(50～500 bp), 其中57条是多态性的(见图2)。AFLP扩增得到的多样性参数高于ISSR扩增得到的结果(见表3)。对于ISSR 分析,引物多态性(PPB)为22.64%，每个位点的有效等位基因数(Ne)是0.3218,Shannon信息指数(I)是0.254 1，Nei′s基因多样性(H)为0.1766，有效多态率(E)和标记指数(MI)分别为2.40和0.42；对于AFLP分析, PPB为22.27% ,每个位点的有效等位基因数(Ne)是0.351 8,Shannon信息指数(I)是0.269 4，Nei′s基因多样性(H)为0.189 5，有效多态率(E)和标记指数(MI)分别为9.42和1.78。表1   筛选出的ISSR引物序列及扩增条带数目（略）表2  筛选出的AFLP引物序列及扩增条带数目（略）
       3.2 同样样本遗传距离与聚类结果比较根据ISSR 分析表明, Nei′s 遗传距离介于0.029 5～0.074 4之间，所有个体的平均遗传距离为0.0518 5，新都种群与都江堰种群之间的遗传距离较大，崇州种群与都江堰种群之间遗传距离较小。遗传一致度的变化范围为0.931 8～0.978 3，平均遗传一致度为0.956 2；AFLP分析得到的30个川芎的遗传距离在0.025 4～0.070 7之间，平均遗传距离为0.050 2，其中崇州种群与都江堰种群之间遗传距离较小，崇州与新都种群之间的遗传距离最大；遗传一致度在0.932 0～0.971 1之间，平均遗传一致度为0.955 4。两种标记的结果均说明，川芎在崇州、都江堰和新都种群之间的相似性较高但也存在着相当程度的遗传分化。但是二者揭示的结果有一定的差异。用NTSYS-pc Version 2.10e 软件计算了基因遗传相似度，进而用UPGMA法聚类，结果(见图3～4)表明，ISSR和AFLP标记分别得到了基本相近但不完全相同的聚类图。对于ISSR分析来说，崇州的10个个体(1～10)聚在了一起，都江堰(11～20)和新都(21～30)出现了极个别的交叉。AFLP分析来看，都江堰的聚在一起，崇州的分成了两部分，新都的也分成了两部分。表3  ISSR 与AFLP 分子标记比较（略）
       3.3 ISSR与AFLP之间的相关性分析为了检测ISSR与AFLP分析的相关程度,利用Mantel检验对基于两种标记的遗传一致度矩阵进行相关性分析。结果表明，两种标记分析的遗传一致度的成显著的正相关( r =0.6975,P=0.014)。
       4 讨论
       4.1 多态性效率比较分析ISSR和AFLP的效率对比研究表明，川芎具有较低的遗传多样性以及ISSR和AFLP的多态性得率很接近。Tusark B.研究苦瓜时测得的ISSR和AFLP的多态性(PPB)分别为74.5%和78.5%［14］，比较接近，和本实验测得的基本一致。然而AFLP的标记指数比ISSR的高。AFLP 的标记指数高是由于AFLP有比较高的E值，而不是H的较大差异，这和其他人研究发现也是一致的［13］。AFLP有比较高的E值是和AFLP标记原理有关。因此,两种标记均能够有效地应用于川芎的遗传多样性分析,其分析得到的结果较为相近,均揭示出川芎具有较低的遗传多样性水平。相对而言,AFLP的检测效率比较高。
       4.2 遗传距离及聚类由ISSR和AFLP分析都得到崇州和都江堰的遗传距离比较小，说明这两个地方的川芎亲缘关系比较近。利用Mantel检测相关性，也揭示出两种标记分析所得的遗传一致度具有显著的相关性。而且30个个体的聚类分析得到ISSR和AFLP标记的聚类图形状也较为相似。因此ISSR与AFLP两种标记均能检测出川芎遗传多样性,而且二者的分析结果相互印证。同时两种标记分析结果也存在着一定的差异,在AFLP聚类中,来自崇州的10个个体没有聚在一起而ISSR标记的聚类图它们聚在了一起。产生这种差异的原因可能为：①两种标记生物学基础不同,ISSR标记是对微卫星之间的基因组DNA进行PCR扩增, AFLP标记是对特异限制性片段的扩增；②引物不同, AFLP采用的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，ISSR引物是15～24个碱基的重复锚定引物,不同的引物检测得到的多态性不一样,并且多态片段数随着引物数的增加而增加,必然引起遗传距离的变异［15］；③AFLP采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,分辨率比较高，能扩增出更多的条带。
       
       总之，AFLP标记更为敏感,更能够检测出更为细微的遗传变异，是适合于川芎的比较高效的分子标记，ISSR较经济。
       【参考文献】
         　　［1］刘园, 贾敏如. 川芎品种、产地的历史考证［J］. 中药材，2001,24(5): 364.
       
       ［2］丁德蓉, 陈兴福,卢进，等. 生态环境对川芎产、质量的影响［J］. 生态学杂志,1994,13(1): 57.
       
       ［3］曹阳, 王铁杰,王玉，等. HPLC法测定不同产地川芎中川芎嗪的含量［J］. 药物分析杂志, 2005,25(3):278.
       
       ［4］张村,李丽,耿立冬，等. 川芎药材有效成分鉴别及其含量标准研究［J］. 北京中医药大学学报,2005,28(2): 66.
       
       ［5］Singh AK, Behera TK, Chandel D, et al. Assessing genetic relationships among bitter gourd (Momordica charantia L.) accessions using inter simple sequence repeat (ISSR) markers［J］. J Hort Sci Biotechnol, 2007, 82: 217.
       
       ［6］Bonin A , Pompanon F, Taberlet P. Use of amp lified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity［J］. Methods Enzymol, 2005, 395: 145.
       
       ［7］Behera TK, Gaikwad AB, Singh AK,et al. Comparative analysis of genetic diversity in Indian bitter gourd (Momordica charantia L.) using RAPD and ISSR markers for developing crop improvement strategies［J］. Sci Hort, 2008, 115: 209.
       
       ［8］Qun Li,Meng Xiao,Liang Guo, Genetic diversity and genetic structure of an endanger species, Trillium tschonoskii［J］. Biochemical genetics, 2005, 43: 445.
       
       ［9］Li YX, Li SS, Li LH, et al, Compairsion of genetic of diversity of twelve Elymus species using ISSR and SSR markers［J］. Sci Agri, 2005,38(8): 1522.
       
       ［10］关萍, 康冀川. 兰科植物天麻基因组DNA提取方法的比较研究［J］. 山地农业生物学报,2004,23(5): 422．
       
       ［11］邹喻苹,葛颂,王晓东. 系统与分子进化植物学中的分子标记［M］. 北京: 科学出版社,2001：16.
       
       ［12］关萍,石建,陈放. 天麻AFLP反应体系的建立及优化［J］.中国中药杂志，2007,32(20):2188.
       
       ［13］Genhua Yue, Yang Li, Fan Chen，et al.Comparison of three DNA maker systems for assessing genetic diversity in Asion arrowana［J］. Electrophoresis， 2002,23: 1025.
       
       ［14］Tusark Behera, Ambika B, Gaikward，et al.Short communication relative efficiency of DNA makers(RAPD, ISSR and AFLP) in detecting genetic diversity of bitter ground［J］. J Sci Food Agric， 2008, 88:733.
       
       ［15］Zhou YQ, Jing JZ, Li ZY, et al. Assessment of genetic diversity of Rehmannia glutinosa germp lasm detected by RAPDs and ISSRs. Hereditas, 2004, 26 (6) : 922.