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       【摘要】 
       目的探讨川芎嗪对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)中血小板源生长因子（PDGF）表达的影响。方法培养大鼠主动脉VSMC，以 10-7mol/L AngⅡ刺激作为AngⅡ组 ，AngⅡ刺激前分别应用不同浓度川芎嗪预处理做为高、中、低剂量组，以正常的VSMC为对照组，测定VSMC增殖活度，免疫细胞化学法检测培养24h时VSMC PDGF-B的表达。结果AngⅡ组VSMC增殖活度与 PDGF-B表达显著高于对照组(P<0.01)。与AngⅡ组比较，川芎嗪中、高剂量组VSMC增殖活度明显降低(P<0.05或P<0.01)、PDGF-B表达水平均显著低于AngⅡ组(P<0.05或P<0.01)。结论川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMC增殖有显著抑制作用，其机制与抑制PDGF-B介导的信号转导有关。
       【关键词】  川芎嗪 血管紧张素Ⅱ 血管平滑肌细胞 血小板源生长因子
       经皮冠状动脉腔内成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA）后再狭窄一直是冠心病治疗领域的一大难题，血管平滑肌细胞(vascular　smooth　muscle　cell，VSMC)异常增殖是PTCA术后再狭窄的一个重要病理改变［1］。有文献报道，血管紧张素II(angiotensin II,AngⅡ)、血小板源生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）在VSMC增殖中作用明显［2，3］。本研究以体外原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞为模型，观察AngⅡ与PDGF-B表达的关系以及川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对其影响，探讨TMP对VSMC增殖的作用机制。
       1  材料与方法
       1.1  动物及试剂　　
       体重120～150 g的健康雄性SD大鼠 （河南省实验动物中心）。盐酸川芎嗪注射液（无锡市第七制药公司），DMEM培养基干粉（Sigma）、细胞培养器材、胎牛血清、胰蛋白酶购自华美生物工程公司；AngⅡ（Merck公司），PDGF-B抗体（博士德），sm-actin免疫试剂盒（Santa Cruz），其它试剂为分析纯产品。
       1.2 细胞培养与鉴定   　
       将大鼠断头处死，无菌条件下迅速打开胸腔，取出胸主动脉，按组织贴块法在细胞培养箱内以含20%胎牛血清的DMEM培养。光镜下以及倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形，生长至融合状态时呈现特有的峰与谷特点，同时经sm-actin免疫细胞化学染色鉴定，细胞纯度达95%以上。选择4-6代VSMC进行实验。
       1.3 实验分组  　
       ①对照组(control)：不加特殊试剂，仅给予无血清DMEM培养；②AngII组：AngII 10-7mol/L培养；③TMP低剂量组：20 mg/L TMP预孵育30 min后，加AngⅡ培养；④TMP中剂量组：200 mg/LTMP预孵育30 min，加AngⅡ培养；⑤TMP高剂量组：2 000 mg/L TMP预孵育30 min，加AngⅡ培养。
       1.4 检测细胞增殖活度
       采用MTT法。按上述方法接种于96孔培养板中培养48 h后终止，换无血清DMEM培养24 h，分组（同前）继续培养24 h，每孔加入MTT溶液20 μl，吸去培养上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜振荡；选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值（A值）。
       1.5 免疫细胞化学法检测
       PDGF-B的表达0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为5×104/L，接种于内置有盖玻片的6孔培养板中培养48 h，无血清DMEM培养24 h，分组（同前）继续培养24 h。培养细胞爬片用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%过氧化氢中孵育10 min；滴加复合消化液后滴加封闭血清，37℃，30 min，滴加PDGF-B一抗（1∶200），4℃过夜，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min。DAB 显色，中性树胶封片。
       1.6 计算机图像分析 
       每一张涂片400倍显微镜下随机选择5个视野，计算其平均灰度值，数值越大表示抗原表达量越小。
       1.7 统计学处理数据用±s表示
       计算机统计软件分析SPSS11.0，采用One-way ANOVA分析，两两比较LSD检验。
       2 结 果
       2.1 TMP对AngⅡ刺激的VSMC增殖活度的影响
       AngⅡ组细胞增殖活度明显高于对照组（P<0.01）；与AngⅡ组比较，中、高剂量组TMP的细胞增殖活度均显著降低（P<0.05或P<0.01）。低剂量TMP的细胞增殖活度无显著差异，但有下降趋势。说明TMP能呈剂量依赖性地抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖效应。结果见表1。表1  TMP对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖活度与PDGF-B表达的影响（略）
       2.2 TMP对AngⅡ诱导的VSMC PDGF-B表达的影响
       显微镜下观察，PDGF-B阳性表达为VSMC胞浆与胞核呈棕黄色反应，主要为胞浆表达。与对照组相比，AngⅡ刺激24h后，VSMC表达PDGF-B显著增强(P<0.01)，与AngⅡ组比较，中、高剂量TMP处理，PDGF-B表达水平均显著降低（P<0.05，P<0.01），低剂量TMP处理后PDGF-B表达水平无明显差异，但呈下降趋势，说明TMP能以浓度依赖方式降低PDGF-B表达水平。各组PDGF-B的平均灰度值见表1。
        
       3 讨论
       TMP是从中药川芎中分离提纯的有效成分，其化学结构为四甲基吡嗪。广泛用于高血压病、冠心病等的防治。研究表明TMP具有扩张冠状动脉、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注损伤降低血压、降低肺动脉高压以及抑制血管平滑肌细胞增殖等多种心血管药理作用［4］。TMP可能通过抑制VSMC增殖发挥抗血管再狭窄作用，但其具体分子机制尚不清楚。
       
       我们先前的研究表明［5］，血管损伤后再狭窄时血浆AngⅡ水平显著升高，血管壁PDGF-B表达显著增强。PDGF是由血小板、平滑肌细胞等分泌的一种糖蛋白，其家族目前至少有4个亚基，即PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D。其中由PDGF-A，PDGF-B形成的同源二聚体具有强烈的促进有丝分裂及细胞趋化作用，在体外可刺激心肌细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等多种类型细胞的肥大或增殖。PDGF与其膜表面受体结合，激活受体的内源性酪氨酸激酶活性，通过磷酸化胞浆中的信号分子，最终将信息传递到核内，导致VSMC增殖［6］。
       本实验结果显示，AngⅡ诱导的VSMC PDGF-B表达水平显著高于对照组，同时VSMC增殖活度增强。提示AngⅡ可以通过上调PDGF-B表达、增强PDGF-B介导的细胞信号通路进一步促进血管平滑肌细胞增殖；不同剂量的TMP作用后，AngⅡ诱导的VSMC PDGF-B表达水平显著下调，VSMC增殖活度显著减弱。说明TMP能抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖，该效应与抑制PDGF-B表达有关；在相同培养时间内，随着TMP浓度增加，细胞增殖活度及PDGF-B表达水平逐渐降低，说明TMP的抑制作用具有量效关系。
       综上所述，川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMC增殖有显著抑制作用，其作用机制与抑制PDGF介导的信号转导有关。
       【参考文献】
         　　［1］Yang W, Ge J, Liu H,et al. Arsenic trioxide eluting stent reduces neointima formation in a rabbit iliac artery injury model［J］.Cardiovasc Res, 2006 ,72(3)：483.
       
       ［2］罗德生，郑红花，李映红，等.川芎嗪抗血管紧张素Ⅱ诱导的离体培养血管平滑肌细胞增殖的实验研究［J］.时珍国医国药，2006，17（3）：321.
       
       ［3］Kim TJ, Yun YP. Antiproliferative activity of NQ304, a synthetic 1,4-naphthoquinone, is mediated via the pressions of the PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways in PDGF-BB-stimulated vascular smooth muscle cells［J］. Vascul pharmacol, 2007,46(1)：43.
       
       ［4］梁爱群.川芎嗪的药理及机理研究［J］.时珍国医国药，2005，16（6）：532.
       
       ［5］孙银平，王省，张大伟，等. 川芎嗪对大鼠颈总动脉损伤后ET、AngⅡ与血小板源生长因子表达的影响［J］.时珍国医国药,2009,20（2）：277.
       
       ［6］Lee S, Lim HJ, Park HY, et al.Berberine inhibits rat vascular smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and improves neointima formation after balloon injury in vivo. Berberine improves neointima formation in a rat model. Atherosclerosis, 2006,186(1)：29.