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       【摘要】 
       目的筛选适合分离纯化补骨脂黄酮的大孔吸附树脂并确立纯化工艺参数。方法以树脂对补骨脂黄酮的吸附量和解吸率为考察指标，选用7种型号的大孔吸附树脂进行纯化。结果LSA-21树脂吸附和解吸效果最佳，最优工艺条件为:补骨脂黄酮上样液的质量浓度为1.449～1.736 mg/ml，吸附流速为1 ml/min，洗脱剂为90%乙醇，洗脱流速为1 ml/min，洗脱剂用量为8倍柱床体积。结论LSA-21树脂在所确定的工艺条件下，可较好地分离纯化补骨脂黄酮。
       【关键词】  补骨脂 黄酮 大孔吸附树脂
       Study on the Isolation and Purification of Flavonoids from Psoralea corylifolia with Macroporous Resin
       ZHANG Xiaoxi, LI Chongjiu, ZHANG Zhuang, WANG Ying, LI Nan
       Department of Applied Chemistry, China Agricultural University, Beijing 100193, China
       Abstract:ObjectiveTo screen the suitable resin for purification of flavonoids from Psoralea corylifolia and to establish the optimum technological parameters of purification. MethodsAccording to the absorption capacity and elution ratio of the resin, seven types of macroporous resin were used to purify the flavonoids from Psoralea corylifolia. ResultsThe results indicated that the absorption capacity and elution ratio of LSA-21 type of macroporous resin were the best in these types of macroporous resin. The optimum extraction conditions were that the concentration and the current velocity of the original solution were 1.449～1.736 mg/ml and 1 ml/min. The eluant was 90% ethanol and the eluting velocity was 1 ml/min. The consumption of eluant was 8 times bed volume.ConclusionIn this condition, LSA-21 type of macroporous resin showed good isolation and purification capability of the flavonoids from Psoralea corylifolia.
       Key words:Psoralea corylifolia;  Flavonoids;  Macroporous absorption resin
       中药补骨脂始载于《开宝本草》，为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，别名破故纸、黑故子、胡故子等，其性温，味辛，具补肾助阳之功效。在传统的中医临床上主治肾虚冷泻，阳痿，小便频数，腰膝冷痛，虚寒喘咳等病症。据现代研究表明，补骨脂还具有抗肿瘤，抗菌，抗骨质疏松，雌激素作用以及治疗白癜风等多重药理活性。补骨脂所具有的这些药理活性与其所含的活性成分有着密切联系［1］。补骨脂中的化学成分主要为香豆素类和黄酮类，也含有单萜酚类。本实验采用大孔吸附树脂法对补骨脂中黄酮类物质进行纯化富集，通过对7种树脂的静态吸附解吸和动态吸附解吸筛选实验，寻找到对补骨脂黄酮具有较好吸附解吸性能的树脂，并研究了该树脂吸附解吸的工艺条件。此采用大孔吸附树脂对补骨脂中黄酮物质进行纯化富集的研究还未见报道。该研究为补骨脂黄酮的分离纯化提供了实验方法并为大量生产中的应用提供技术参数。
       1 仪器与材料
       722光栅分光光度计，上海精密科学仪器公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；BP211D型电子分析天平，德国sartorius公司；恒温振荡器，常州国华电器有限公司。补骨脂药材，购于同仁堂药店。芦丁对照品(纯度为99.76%)，南京替斯艾么中药技术研究所，批号：TCM027-080118；XDA-1，SP825，LSA-21，D101，AB-8，LSA-30，D4020树脂，日本三菱（购于北京慧德易科技有限公司）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 黄酮含量的测定
       2.1.1 绘制标准曲线［2］
       精密称取芦丁对照品21.02 mg，加60%乙醇充分溶解，置于100 ml容量瓶中，定容即得对照品溶液。分别移取芦丁对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置于25 ml容量瓶中，用60%乙醇补充至6 ml，加5%亚硝酸钠1 ml，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝1 ml，摇匀，放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液10 ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min后以第1份作为对照于505 nm（经全波长扫描确定505 nm为最大吸收波长）波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，溶液浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:A=0.012 9 C-0.012 9，r=0.999 9，线性范围：8.388～50.33 μg/ml。见图 1。
       2.1.2 补骨脂样品液的制备及黄酮含量测定
       将补骨脂药粒粉碎，称取补骨脂药粉12 g，加10倍量90%乙醇加热回流提取3次，2 h/次，过滤，合并滤液［3］，用90%乙醇稀释至500 ml，作为样品溶液。量取0.5 ml于25 ml容量瓶中，按“2.1.1”项绘制标准曲线项下进行操作，测定并计算其黄酮含量。
       2.2 大孔吸附树脂预处理
       所用树脂均先用95%乙醇浸泡24 h，使树脂颗粒充分溶涨，然后用95%乙醇洗涤至洗出液与水混合不呈白色浑浊为止，再用去离子水洗至无醇味［2］。
       2.3 树脂的筛选［4］
       2.3.1 树脂静态吸附量和解吸率的测定
       称量处理好的XDA-1，SP825，LSA-21，D101，AB-8，LSA-30，D4020树脂各1 g，分别置于50 ml带磨口塞的三角瓶中，精密加入补骨脂样品液10  ml，置振荡器上振摇，24 h后取1 ml上清液至25 ml容量瓶，测定并计算吸附后的溶液剩余浓度。按下式计算各树脂室温下的吸附量（mg/g）:吸附量=(起始浓度-剩余浓度)×溶液体积/树脂质量。
       
       经静态吸附后的树脂过滤抽干，分别精密加入90%乙醇10 ml解吸，相同条件下振摇24 h后取1 ml上清液至25 ml容量瓶，测定并计算解吸液浓度。按下式计算解吸率:解吸率（%）=（解吸液浓度×解吸液体积）/吸附量×100%。结果见表 1。表1  大孔吸附树脂对补骨脂黄酮的静态吸附量与解吸率（略）
       
       2.3.2 树脂动态吸附率和解吸率的测定取已处理好的7种树脂各6 g湿法装柱，测量其柱床体积为10 ml，加等柱床体积10 ml补骨脂样品液于柱顶，以相同流速进行动态吸附，然后用等量去离子水清洗树脂床中未被吸附的成分，一并收集流出液。测定并计算流出液的浓度，按下式计算树脂的吸附率：吸附率（%）=［(样品液浓度×样品液体积)-(流出液浓度×流出液体积)］/(样品液浓度×样品液体积)
       
       将上述充分吸附后的树脂分别用等量90%乙醇以相同的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定并计算洗脱液中黄酮浓度，计算解吸率(%)。结果见表2。表2  大孔吸附树脂对补骨脂黄酮的动态吸附率与解吸率（略）
       由表1，2结果可以看出，7种大孔吸附树脂中LSA-21在静态吸附解吸实验和动态吸附解吸实验中均具有较好的吸附能力和解吸能力。XDA-1树脂和SP825树脂虽然在静态和动态筛选实验中均表现较好的吸附能力，但其解吸率均较低，不适合补骨脂黄酮的分离纯化；在动态实验中解吸率略高于LSA-21树脂的D101树脂其吸附能力不如LSA-21树脂且其静态吸附解吸能力均不如LSA-21树脂。因此结合静态筛选实验和动态筛选实验，综合考虑，确定LSA-21树脂是分离纯化补骨脂黄酮效果较好的树脂。
       2.4  LSA-21树脂分离纯化补骨脂黄酮的动态吸附解吸工艺条件优化［5～7］
       2.4.1 最佳上样浓度的确定将6种不同浓度的样品溶液10 ml（一个柱床体积）分别以相同流速通过LSA-21树脂柱进行动态吸附。然后用等量去离子水清洗树脂中未被吸附的成分，一并收集流出液。测定并计算流出液的浓度，计算黄酮吸附率，确定最佳上样浓度。结果见表 3。表3  上样浓度对黄酮吸附率的影响（略）
       
       从表3可以看出，随着样品浓度的增加，吸附率呈现先升高再降低的趋势。在较低浓度时，树脂对补骨脂黄酮的吸附率随上样浓度的增加而增加，但相差不大；随着上样液黄酮浓度的提高，当超过1.736 mg/ml时吸附率有明显降低。因此，上样溶液中黄酮的浓度以1.449～1.736 mg/ml左右为宜。
       2.4.2 最佳吸附流速的确定将黄酮浓度为1.728 mg/ml补骨脂样品液10 ml通过LSA-21树脂柱，分别控制流速为0.5，1，2，4 ml/min进行吸附。然后用等量去离子水清洗树脂床中未被吸附的成分，一并收集为流出液。测定并计算流出液的浓度，计算黄酮吸附率，确定最佳吸附流速。结果见图 2。
        吸附流速越慢被吸附物质越能和树脂充分接触，从而能更好地吸附在树脂上，但是工作效率会大大下降。流速越快，被吸附物质来不及扩散到树脂表面就会发生泄漏。从图2可以看出，随着流速增大吸附率会下降，在0.5 ml/min和1 ml/min流速下进行吸附时，吸附率均超过90%且相差不大，所以综合考虑吸附效果和工作效率，确定吸附流速采用1 ml/min。
       2.4.3 泄漏曲线的绘制将6 g LSA-21树脂湿法装柱，一个柱床体积为10 ml。取浓度为1.728 mg/ml的样品溶液于柱顶，以1 ml/min的流速上样，每10 ml收集一个流分，测定并计算每份收集液中黄酮浓度，绘制泄漏曲线。结果见图3。
       从图3可以看出，上样量在10倍柱床体积后，泄漏量已经基本不变，树脂达到吸附平衡；上样量为1倍柱床体积时基本无泄漏，当上样量为2倍柱床体积时泄漏量明显上升，所以树脂载样量为1倍柱床体积。
       2.4.4 洗脱剂浓度的确定按上述确定的吸附条件进行动态吸附后，用等量去离子水洗去未吸附成分，再分别用等量不同浓度的乙醇溶液以相同流速进行洗脱，收集洗脱液，测定并计算洗脱液中黄酮含量，计算黄酮解吸率。结果见图4。
       
       从图4可以明显看出用90%乙醇洗脱效果最佳，解吸率超过90%，所以确定最佳洗脱剂为90%乙醇。
       2.4.5 最佳洗脱流速的确定按上述确定的吸附条件进行动态吸附后，用去等量离子水洗去未吸附成分，再分别用等量浓度为90%的乙醇溶液以0.5，1，2，4 ml/min流速进行洗脱，收集洗脱液，测定并计算洗脱液中黄酮含量，计算解吸率。结果见图5。
       从图5可以看出，随着洗脱流速的增大解吸率会下降，在0.5 ml/min和1 ml/min流速下进行洗脱时，解吸率均超过90%且相差不大，2 ml/min流速下洗脱时解吸率下降明显，所以综合考虑解吸效果和工作效率，确定洗脱流速为1 ml/min。
       2.4.6 洗脱曲线的绘制按上述确定的吸附条件进行动态吸附后，用等量去离子水洗去未吸附成分，取90%乙醇于柱顶，以1 ml/min的流速进行洗脱，每10 ml（一个柱床体积）收集一个流分，测定并计算每份收集液中黄酮浓度，绘制洗脱曲线。结果见图6。
       从图6可以看出，当洗脱液体积在8倍柱床体积后洗脱液浓度明显降低且黄酮含量极低，可认为树脂上吸附的黄酮已经基本洗脱完全，所以洗脱剂用量确定为8倍柱床体积。
       3 讨论
       本实验通过静态和动态吸附解吸筛选，考查了XDA-1，SP825，LSA-21，D101，AB-8，LSA-30，D4020树脂对补骨脂黄酮的吸附与解吸能力。综合静态和动态筛选并进行比较，确定吸附能力和解吸能力都较好的LSA-21树脂为分离纯化补骨脂黄酮物质的最佳树脂。所以选定LSA-21大孔树脂为主要研究对象。
       
       本实验利用大孔吸附树脂动态吸附解吸，对LSA-21大孔吸附树脂分离纯化补骨脂黄酮的工艺条件进行研究。结果表明，最佳工艺条件为:浓度为1.449～1.736 mg/ml补骨脂黄酮上样液，以1 ml/min的流速上样，再用8倍柱床体积、90%的乙醇，以1 ml/min流速进行洗脱。以此工艺条件分离纯化补骨脂黄酮效果最佳且效率最高。
       
       本实验使用乙醇作为溶剂和洗脱剂安全无毒；以芦丁比色法作为黄酮含量的测定方法简便易行，因在可见光范围内测定故对实验仪器要求较低。为大规模生产提供数据支持，并为进一步分离单一组分和研究药理活性等提供帮助。
       【参考文献】
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