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       【关键词】  人参二醇组皂苷；,,人参皂苷Rb1；,,黑色素细胞；,,黑色素；,,一氧化氮合酶
       摘要：目的探讨人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1对体外培养的黑色素细胞及黑色素合成的调节作用及机制。方法①将黑色素细胞进行体外培养、传代；用人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1进行干扰，观察细胞的生长情况，测量细胞OD值；②免疫组织化学技术显示黑色素细胞的一氧化氮合酶的表达的改变。结果对照组与人参二醇组皂苷实验组、人参皂苷Rb1实验组的细胞生长OD值无显著性差异（P>0.05），对照组与人参二醇组皂苷实验组、人参皂苷Rb1实验组的一氧化氮合酶表达有显著性差异（P<0.05）。结论 人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1对黑色素细胞的生长、增殖无影响，但对培养黑色素细胞一氧化氮合酶的表达具有抑制作用。
       关键词：人参二醇组皂苷；  人参皂苷Rb1；  黑色素细胞；  黑色素；  一氧化氮合酶
       The Effects of Panaxadiol Saponins and Ginsenoside Rb1 on Cultivation Melanocytes in vitro
       CHENG Jiyan ， ZHONG Guishu ， HAN  Yi， YU Hong
       （Department of Histology and Embryology，Luzhou Medical College，Sichuan 646000，China；Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Luzhou Mediical College，646000，Sichuan Province，China）
       Abstract：ObjectiveTo discuss the effects and regulation mechanism of Panaxadiol saponins and Ginsenoside Rb1 on cultivation melanocytes and melanin synthesis in vitro. Methods①Culture and passage the melanocytes in vitro；interfere the melanocytes with Panaxadiol saponins and Ginsenoside Rb1，then observe the growth of the cells and measure the OD；②Display the change of expression of nitric oxide synthase in the melanocytes with immunohistochemistry. ResultsThe OD had no significant difference between the control group and treatment group of Panaxadiol saponins or Ginsenoside Rb1（P>0.05），the expression of nitric oxide synthase had significant difference between the control group and treatment group of Panaxadiol saponins or Ginsenoside Rb1（P<0.05）.ConclusionThe Panaxadiol saponins and Ginsenoside Rb1 can not affect the growth and proliferation of melanocytes, but can inhibit the expression of nitric oxide synthase in melanocytes.
       Key words：Panaxadiol saponins；  Ginsenoside Rb1；  Melanocyte；  Melanin；  Nitric oxide synthase
   
　　皮肤疾病的治疗和皮肤的保健是当今医学界的一个热门话题。临床上，与黑色素细胞（melanocyte）相关的黄褐斑、雀斑、黑变病、妊娠斑、白癜风、白化病等疾病，美容学上黑色素（melanin）对皮肤的颜色的决定作用，都是目前医学界的一个热门话题。因此，对黑色素细胞的研究必然会对美容学和皮肤病学产生重要的影响。信使分子一氧化氮(nitric oxide；NO)是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase；NOS)催化产生，文献报道表明［1，2］NO供体可以促进黑色素合成增加以及酪氨酸酶的活性增强，提示NO是黑色素合成的强效激活因子。所以NOS的表达可以反应黑色素细胞的功能状态。人参具有保护机体细胞和全身免受应激的影响，降低血糖和血胆固醇，促进新陈代谢等功能，目前已经广泛应用于临床的许多方面，包括在很多皮肤保健品和化妆品内［3，4］。本研究观察用人参的有效成分―人参二醇组皂苷(Panaxadiol saponins；PDS)、人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）对培养黑色素细胞及细胞NOS表达的影响，目的在于阐明人参对黑色素细胞及黑色素合成的调节作用及机理，为临床应用提供实验依据。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料人参二醇组皂苷和人参皂苷Rb1；黑色素细胞株；NOS免疫组化试剂盒；1640培养基；MTT试剂；二甲亚砜；小牛血清；CO2恒温培养箱；无菌操作台；带数码相机XSJD倒置相差显微镜；细胞培养瓶、培养孔板；平板震摇仪；等。
       1.2  方法与结果细胞培养和传代：细胞株复苏后，加1640培养基稀释至3×105/ml，转种于培养瓶培养。细胞以3×105/ml常规传代，倒置相差显微镜下动态观察，根据细胞生长状况和培养基颜色变化及时更换培养基或传代。实验分组与处理方法：用MTT法测定培养细胞的数量变化，以确定黑色素细胞的最佳生长时间为72 h。将细胞稀释成3×105/ml，接种于可拆卸式96孔板，每组12孔，每孔200μl。参照文献采用不同浓度人参二醇组皂苷和人参皂苷Rb1进行干扰并分组：对照组（正常1640培养基，control group；CG）；人参二醇组皂苷实验组（PDS treatment group；按浓度10，20，50 μg/ml 分为PG1、PG2 、PG3）；人参皂苷Rb1实验组（Ginsenoside Rb1 treatment group；按浓度10，20，50 μg/ml 分为RG1，RG2，RG3）。培养72 h后每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，继续培养5 h后，吸弃上清液，每孔加入DMSO 200μl，平板震摇仪上震摇10 min，测OD值(波长490 nm)。免疫组织化学实验：参照文献，用SABC法显示各组NOS［5］。图象分析采用盲法进行。用IS4400图象分析仪，在400倍下进行图象分析，每组随机选取5张切片的25个视野，每个视野2个细胞，由计算机处理系统测定各组黑色素细胞胞质的光密度，结果以+s表示。
       1.3  统计分析 OD值及图像分析资料进行单因素方差分析，组间两两比较采用SNKq法； 以上统计学均采用SPSS 10.0 for windows软件包进行分析。
       2  结果
       2.1  在Olympus显微镜400倍下观察，黑色素细胞为球形，细胞生长迅速，排列紧密，细胞折光性好。对照组和实验组的细胞密度、细胞形态均无显著差异。
       2.2  实验组各组黑色素细胞OD值与对照组之间差异有显著性（P>0.05）；实验组各组NOS表达相互之间比较，差异无显著性（P>0.05）。见表1。
       表1  黑色素细胞OD值统计（略）
       实验组和对照组比较，差异无显著性（P>0.05）；实验组各组间比较，差异无显著性（P>0.05）；n=12
       2.3  黑色素细胞NOS免疫组织化学阳性产物颗粒图像分析仪统计分析结果：实验组各组黑色素细胞NOS表达明显减弱，与对照组之间差异有显著性（P<0.05）；实验组各组NOS表达相互之间比较，差异无显著性（P>0.05）。结果见表2。
       表2  NOS免疫组织化学染色黑色素细胞光密度（略）
       实验组各组NOS表达明显减弱，与对照组之间差异有显著性（P<0.05）；实验组各组NOS表达相互之间比较，差异无显著性（P>0.05）；n=50
       　　3  讨论
       随着社会的发展，大量的色素代谢障碍性疾病成为困扰医学工作者的一个难题；皮肤美白已成为人们日常生活的一个重要内容，雀斑、妊娠斑、老年斑、等黑色素细胞相关疾病期待一个完善的处理方法。随着中药药理学研究方法和技术的迅速进展，近年来应用中药对色素代谢障碍性疾病进行防治已引起人们的注意［6］。
       3.1  人参对黑色素细胞的作用作为传统名贵中药的人参应用于临床已有两干多年的历史。人参二醇组皂苷含有多种皂苷类物质，而单体主要有Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf等，大约有18种。除单体皂苷外还含有蛋白质、酶类、多肽、氨基酸、人参多糖等。现代医学证明人参皂苷具有抗肿瘤、调节免疫功能增强人体表面细胞的活力、抑制衰老、减少氧自由基等作用。目前，人参有效成分提纯技术完善。用提纯品进行研究，灵敏度高，便于在实验中进行浓度控制。本实验从分子水平用免疫组织化学的方法研究人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1对黑色素合成的调控机理，对人参临床应用有重要的意义。实验中选择了10~50 μg/ml浓度范围，主要依据：(1)根据目前已有的文献报导，其研究的浓度范围在此范围之内；(2)参考临床用药的剂量和在人参内的含量。研究结果表明，NOS的表达没有随浓度改变而发生变化，说明人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1作用的有效浓度范围超出10~50 μg/ml浓度范围，从而为临床应用人参的剂量提供实验依据。从另一方面来看，实验中采用的最高实验浓度50 μg /ml，已经达到了10 μg/ml的5倍，NOS的表达在各组比较，差异仍然没有显著性，这也为人参在临床上使用时，毒副作用的预防和控制提供了重要依据。另外，该实验中采用了人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1同时进行研究，从细胞生长OD值及NOS表达方面，两种药物相互间都无显著性差异，说明单体人参皂苷Rb1和复合物人参二醇组皂苷对黑色素细胞及黑素合成的作用是相同或者相似的，这也可以为临床上应用人参时需要提纯到何种程度提供依据。
       3.2  人参对黑色素合成的调节机理黑色素细胞是影响皮肤颜色最为重要的因素。其功能为：产生黑色素→转移到角朊细胞→吸收紫外线→保护基底层细胞。NO是一种信号分子，在NOS的催化作用下生成。有研究表明，NO供体促进黑色素合成和酪氨酸酶的活性，被认为是MC内黑色素合成的强效促进剂。该实验的结果显示，人参二醇组皂苷和人参皂苷Rb1对黑色素细胞内的NOS的表达都有抑制作用。说明，人参二醇组皂苷和人参皂苷Rb1对黑色素细胞内黑色素合成的调节作用，是通过抑制黑色素细胞的NOS活性，从而影响细胞内的NO合成，经NO信号介导通路，发挥它的调节功能。此结果为人参在临床上，用于色素代谢障碍性疾病以及皮肤的美白，提供实验依据［7］。
       3.3  人参的毒副作用和临床安全性在该实验中，人参二醇组皂苷、人参皂苷Rb1的实验浓度采用了10~50μg/ml的范围，在该浓度范围内，黑色素细胞的一般结构特点、细胞数量与对照组比较没有明显的差异。说明此浓度的人参二醇组皂苷和人参皂苷Rb1黑色素细胞生长增殖没有明显影响，也说明可能没有毒副作用或者毒副作用极小。在如此大的浓度范围内，人参二醇组皂苷和人参皂苷Rb1对黑色素细胞NOS的表达的调节作用，差异没有显著性，其意义在于：可以为临床上人参的应用的剂量控制提供依据。同时，人参的有效作用浓度范围较大，主要原因可能是人参等中药在临床上使用时比较安全，毒副作用较小。
       　　参考文献：
       ［1］  RomeroGraillet C，Aberdam E，C1ement M，et a1．Nitric oxide Produced by ultravioletirradiated keratinocytes stimulates  melanogenesis［J］.J C1in Invest，1997，99(4)：635.
       ［2］  程基焱，黄吉春，刘广益．大黄对黑色素合成的调节作用的实验研究［J］.中华实用中西医杂志，2004，17（12）：1909.
       ［3］  朱建明．人参皂苷的抗衰老研究进展［J］.中医药信息，1998，2：18．
       ［4］  寻晓红．人参皂苷的研究进展［J］.中国现代医学杂志，2003，13(15)：43．
       ［5］  程基焱，黄吉春，钟桂书，等．不同浓度雷公藤甲素对光老化皮肤成纤维细胞基质金属蛋白酶的影响：以维甲酸为标准对照［J］.中国临床康复，2005，9（22）：158.
       ［6］  钟桂书，程基焱，陈德宇．大黄素次酸对豚鼠皮肤黑色素细胞一氧化氮合酶的调控作用［J］.岭南皮肤性病科杂志，2005，12 (1)：5.
       ［7］  Chistine RomeroGraillet，Edith Aberdam，Et al．Ul traviolet B radiation acts through the nitric oxide and cGMP singal transduction  pathway to stimulate melanogenesis in human melanocytes［J］.J Biol Chem．1996, 271(45)：28052.
       基金项目：四川省教育厅泸州市科技局资助项目(No.2005B013)
       (泸州医学院，四川 泸州   646000；泸州医学院附属医院，四川 泸州    646000）