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       【摘要】 
       目的研究复合螺旋藻多糖对人胃癌MGC细胞的抑制作用。方法将螺旋藻多糖（PSP）与银杏叶有效成分（GBE）以不同剂量按一定比例复合，观察复合制剂在体外对人胃癌MGC细胞的抑制作用。结果PSP与GBE 1∶1比例复合组、1∶2比例复合组和2∶1比例复合组对人胃癌MGC细胞的抑制率，高剂量时分别比空白对照组提高92.44％（P＜0.01），26.36％（P＜0.01）和71.32％（P＜0.01）；中剂量时分别比空白对照组提高62.37％（P＜0.01），20.57％（P＜0.01）和24.15％（P＜0.01）；低剂量时分别比空白对照组提高27.94％（P＜0.01），30.36%（P＜0.01）和17.92％（P＜0.01）。结论单一成分的螺旋藻多糖组对人胃癌MGC细胞也有较好的抑制作用，并呈剂量依赖性。高、中剂量复合螺旋藻多糖对人胃癌MGC细胞的抑制作用，1∶1比例配比时抑制效果最好。其中高剂量组1∶1配比时抑制率达到92.4％。表明复合螺旋藻多糖在该剂量配比时协同增效作用最大。
       【关键词】  螺旋藻多糖 银杏叶有效成分 人胃癌MGC细胞 抑瘤率
       胃癌是世界上第二大癌症死因，该疾病是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。目前临床上除了手术和放射疗法外，主要采用环磷酰胺等化学合成药物治疗肿瘤疾病，但这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对患者的机体也造成了很大的损伤，因此，筛选无毒副作用的天然药物用来治疗肿瘤疾病成为医学界研究的热点。
       
       螺旋藻多糖作为一类具有重要生物活性的天然多糖化合物，其生物活性已逐渐为人们所认识。研究发现，螺旋藻多糖是一种很好的免疫增强剂，目前已被逐渐应用于临床和药理实验。据报道，银杏叶有效成分具有抗氧化、降血脂、提高免疫力、抗肿瘤等方面的作用［1］，它们的药理作用也不断被认识，临床应用也越来越广泛。本实验将螺旋藻多糖（PSP）与银杏叶有效成分(GBE)按一定比例复合，观察复合制剂在体外对人胃癌MGC细胞的抑制作用。
       1 材料与仪器
       1.1 螺旋藻多糖与银杏叶有效成分螺旋藻购于中国科学院南海海洋研究所三亚站，为浅绿色粉末。参照文献［2］，采用三氯乙酸除蛋白法提取螺旋藻多糖（PSP），多糖含量93％以上；银杏叶有效成分（GBE）为实验室自提，总黄酮含量≥24％，萜内酯含量≥6％。
       1.2 仪器
       超净工作台（苏州净化设备厂）；CO2 恒温培养箱（南京畅翔仪器设备有限责任公司 ）；双目倒置显微镜（凯迪高速分析仪器有限公司）；Model 550 自动酶联检测仪（美国 Bio-rad 公司）。
       1.3 肿瘤细胞人胃癌MGC细胞购于山东省医学科学院药物研究所。
       1.4 试剂及配制
       1.4.1 试剂
       RPMI1640 培养基（Gibco 公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；二甲亚砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司）；噻唑兰（MTT）（Sigma 公司）。
       1.4.2 试剂配制
       细胞培养液的配制：将1 包RPMI 1640，2.0g NaHCO3，青霉素、链霉素各10万 U 和2.0 g Hepes放于烧杯中， 加适量三蒸水在磁力搅拌器上溶解，并定容至 1 L，用 5.6％ NaHCO3溶液调节pH 至7.2～7.4，用 0.22 μm双层滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存。
       
       磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：准确称取Na2HPO4·H2O 1.56 g，KH2PO4 0.20 g，KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，加三蒸水溶解并定容至 1 L，调节 pH 至 7.2， 115.6℃高压蒸气灭菌30 min，并分装成 100 ml/瓶，4℃冰箱保存。
       0.25％胰蛋白酶溶液的配制：称取胰酶0.25 g，EDTA 0.02 g，加入灭菌的 PBS 液 100 ml充分搅拌溶解，调pH 至 7.2～7.4，置 4℃冰箱过夜，0.22μm双层虑膜过滤除菌，并分装入瓶（10ml/瓶）。-20℃冰箱保存备用。
       
       MTT 溶液的配制：称取MTT 250.00 mg，加PBS 50 ml，在磁力搅拌器上搅拌30 min，使 MTT 充分溶解，继续加PBS使MTT溶液的终浓度为 5 mg/ml，用双层0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存，两周内有效。
       1.5 供试药物的配制
       按实验最高浓度的100倍配制母液，溶剂为PBS与DMSO等体积混合物。使用前用培养液稀释到实验设计浓度，最终溶剂在培养液中的浓度不超过1％。各实验组最终药物浓度如表1。表1  实验分组及各实验组药物浓度（略）
       2 方法
          
       首先取对数生长期的人胃癌MGC细胞用胰酶消化，以含10％小牛血清的 RPMI-1640培养液稀释细胞，制成 5×104/ml细胞悬液。将配制好的细胞悬液加入96 孔培养板中，每孔 200 μl，置37℃，5％CO2 培养箱中培养24 h 后，按分组情况加入不同复合比例的供试药物，继续培养72 h，培养结束前 4 h，每孔加MTT 20 μl，继续培养4 h后，直接吸弃上清液，然后加 DMSO 200 μl /孔，微量振荡器振荡 5 min，使深蓝色沉淀物完全溶解。用 Model 550 多孔自动酶标仪比色(波长 570 nm)，测吸光度值，并按以下公式计算生长抑制率：
       
       细胞存活率（％）=抗癌药物组吸光度值/细胞对照组吸光度值×100％。
       抑制率（％）=100％－细胞存活率
       3 结果
        
       由表2可见，高剂量的PSP，银杏黄酮和银杏内酯3种单一成分都对人胃癌MGC细胞有一定的抑制作用，其中PSP的抑制效果较好，银杏黄酮的抑制效果较差。PSP与银杏叶有效成分按3种比例复合使用，其中1∶1比例复合组抑制人胃癌MGC细胞效果最好。表2  高剂量复合螺旋藻多糖对人胃癌MGC细胞的抑制作用（略）
       
       由表3可见，中剂量的PSP，银杏黄酮和银杏内酯3种单一成分对MGC细胞的抑制作用，银杏黄酮效力最高。复合比例的PSP与银杏叶有效成分的抑瘤效果较单一成分高。其中1∶1复合组的效果最好。表3  中剂量复合螺旋藻多糖对人胃癌MGC细胞的抑制作用（略）
         
       由表4可见，低剂量的PSP，银杏黄酮和银杏内酯3种单一成分组以及复合比例的PSP与银杏叶有效成分对人胃癌MGC细胞的抑制作用，银杏黄酮组效果较好；其它组效果不明显。表4  低剂量复合螺旋藻多糖对人胃癌MGC细胞的抑制作用 （略）
       4 讨论
          
       螺旋藻中所含有的最主要的活性成分之一为螺旋藻多糖，它主要由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和葡萄糖醛酸组成，是一种水溶性多糖。李羚等［3］报道利用Fenton反应，螺旋藻多糖能有效清除·OH、O2-·自由基，对脂质过氧化及DNA的·OH氧化损伤有显著抑制作用。于红等［4］报道随螺旋藻多糖浓度的增加HeLa细胞和HeGp-2细胞的存活率逐渐降低，但对正常人二倍体成纤维细胞无影响, 光镜下观察螺旋藻多糖作用 24～48 h后 HeLa细胞出现明显的形态学改变。关燕清等［5］报道螺旋藻多糖可协同固定化藻蓝蛋白对体外培养的人胰腺癌SW1990细胞起抑制作用。在17.5 g/L 螺旋藻多糖存在下，抑制率最高可达到86%。曲显俊等［6］报道螺旋藻多糖治疗后的荷瘤小鼠其脾淋巴细胞产生白细胞介素的功能增强。另外，口服螺旋藻多糖还具有一定提升或恢复因使用环磷酰胺所致动物外周血白细胞降低的作用。
       
       银杏叶成分复杂，主要活性成分为含有苷和酚羟基结构的银杏黄酮、内酯和多糖类。研究发现［7］银杏叶提取物中萜类内酯化合物是血小板激活因子的特异性受体拮抗剂，因此一直是人们关注的焦点所在。虽然目前还没有关于银杏有效成分抗肿瘤的报道，但有研究［4］表明银杏有效成分具有SOD样自由基拮抗作用。银杏叶中的黄酮类化合物具有多方面的生理活性［8］，在心脑血管疾病、抗炎等方面疗效显著。可直接清除多种活性氧簇，如O2-·，NO，·OH，脂质过氧化物等。而肿瘤的发生与氧自由基有着重要的联系。
       
       实验的结果，PSP与银杏黄酮、银杏内酯单独使用对人胃癌MGC在体外就有较好的抑制作用。刘力生等［9］报道螺旋藻多糖能够显著提高机体非特异性的细胞免疫功能和特异性的体液免疫功能。这可能与PSP、银杏黄酮和银杏内酯含有羟基或酚羟基结构有关。其中发现单一的PSP和银杏内酯组对人胃癌MGC细胞的抑制呈剂量依赖趋势。高剂量组的抑制效果明显优于中、低剂量组。王晓杨等［10］报道螺旋藻多糖可促进ConA诱导的体外小鼠淋巴细胞转化，且表现出剂量依赖关系。而实验发现银杏黄酮的剂量与抑瘤作用呈负相关趋势。
       
       有研究发现［5］含有相同或类似官能团的化合物进行复合，能够使药物发挥协同增效作用。螺旋藻多糖和银杏叶有效成分都含有羟基或酚羟基结构，这为两种活性物质联合使用发挥协同增效提供了基础。本实验表明，在高、中剂量时PSP与GBE复合1∶1使用对人胃癌MGC的抑制率高于PSP、银杏黄酮和银杏内酯单一使用组。PSP与GBE复合使用，在对人胃癌MGC的抑制作用上1∶1复合时协同增效作用发挥至最大，尤其高剂量复合时达到92.44%。说明复合螺旋藻多糖抑瘤率的高低与PSP与GBE的剂量、配比有关。这可能是由于螺旋藻多糖与银杏叶有效成分按此剂量、比例搭配，可以使复合制剂中的苷、羟基、酚羟基和糖苷键等活性基团相互促进产生最大的协同增效作用。
       【参考文献】
         　　［1］刘宗敏，张慧，戴梓茹，等.银杏黄酮的生理作用研究现状及发展前景［J］.湖南林业科技，2006，33（6）:75.
       
       ［2］钱志刚.螺旋藻多塘提取新工艺研究［J］.淮海工学院学报，2000, 9（2）:50.
       
       ［3］李羚,高云涛，戴云，等.螺旋藻及螺旋藻多糖体外清除活性氧及抗氧化作用研究［J］.化学与生物工程，2007，24（3）:55.
       
       ［4］于红，张学成.螺旋藻多糖抗肿瘤作用的实验研究［J］.高技术通讯，2003，13（7）:83.
       
       ［5］关燕清,郭宝江.藻多糖对固定化藻蓝蛋白抑癌作用的影响［J］.营养学报，2002（3）:252.
       
       ［6］曲显俊,崔淑香，解砚英，等.螺旋藻多糖抗癌作用的实验研究［J］.中国海洋药物，2000，19（4）:10.
       
       ［7］王雁,杨义芳.银杏叶的药理作用及其机制的研究进展［J］.中国现代应用药学杂志，2001，18（18）:1.
       
       ［8］孙芳华,王宗德.银杏叶黄酮类化合物研究及开发利用现状［J］.江西林业科技，1999，27（6）:41.
       
       ［9］刘力生,郭宝江，阮继红，等.螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及其机理的研究［J］.海洋科学，1991，15（5）:33.
       
       ［10］王晓杨,于红.螺旋藻多糖体外对小鼠免疫功能的影响［J］.实用中医药杂志，2004，20（9）:482.