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       【摘要】 
       目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法测定不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的影响；Hoechst 33258检测白花蛇舌草乙醇提取物作用后细胞凋亡情况；流式细胞仪检测药物作用后的细胞周期和凋亡率；Western Blot 检测药物作用后的Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果白花蛇舌草乙醇提取物抑制A549细胞增殖呈时效和量效关系；Hoechst 33258检测白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞后可见凋亡细胞；40 mg/ml白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞12，24，36，48h，药物组G1～G0期细胞百分比分别为（42.82±3.95）%，（51.84±6.37）%，（54.76±8.85）%和（64.94±7.56）%，药物组细胞凋亡率分别为（5.72±0.98）%，（7.10±2.08）%，（19.89±4.25）%，（32.55±6.51）%，均高于对照组（P均﹤0.05），且G1～G0期细胞百分比和凋亡率随药物作用时间增加而增加；Western Blot显示，白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞，Bax的表达随作用时间增加而增加，Bcl-2的表达随作用时间增加而减低。结论白花蛇舌草乙醇提取物随着药物浓度和作用时间的增加对肺腺癌A549细胞的体外抑制效应增加；其抑制作用可能通过将细胞周期阻滞于G1～G0期和通过上调Bax和下调Bcl2的表达而诱导细胞凋亡来实现的。
       【关键词】  白花蛇舌草乙醇提取物 细胞周期 凋亡 人肺腺癌A549细胞
       原发性支气管肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一。近30年来，其发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势。肺腺癌在原发性支气管肺癌中极为常见，传统化疗和放疗对肺腺癌效果均不甚理想［1］。白花蛇舌草Hedyotis diffusa 为茜草科耳草属植物。中医以其全草入药，性寒，味甘淡，归心、肺、肝、大肠经；清热解毒，利尿；主治恶疮肿毒、泻痢等症，临床常用于治疗各类癌症［2］。研究表明［3］，不同工艺白花蛇舌草提取物抗肿瘤作用有差异：乙醇提取物＞冷水提取物＞煎煮提取物。我们通过研究白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，揭示白花蛇舌草抗肺腺癌可能的作用机制，为临床应用提供理论依据。
       1 材料与方法
       1.1 药物和试剂
       白花蛇舌草购于湖北省药材公司。取白花蛇舌草全草50 g，粉碎研磨，95%乙醇搅拌浸泡15 d，滤去残渣，水浴至液体全部蒸发干，而后加入ddH2O 50 ml溶解，得到生药浓度为1 g/ml，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存，用前用DMEM培养基稀释至所需浓度。碘化丙啶（PI）购于Pharmingin公司（晶美公司代理）。Hochest33258购于Sigma公司。鼠抗人Bax、Bcl-2及β-actin单抗购自美国Santa Cruz公司。
       1.2 细胞及其培养
       肺腺癌细胞株A549购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，用含10％小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培养基（Gibco公司），在含5％CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。
       1.3 MTT试验
       A549细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105 ml-1，接种于96孔板，每孔100 μl。分设对照组和不同浓度药物组（5，10，20 ，40 ，80 mg/ml），每孔设6复孔，分别培养1，2，3，4 d；每孔加入5 g/L MTT10 μl，继续孵育4 h，每孔加入200 μl二甲基亚砜（DMSO）终止，振荡15 min，450型ELISA-Reader酶标仪（Bio-Rad公司）570 nm主波长，630 nm副波长检测吸光度。以对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的抑制率：细胞抑制率（%）＝(1－药物组吸光度/对照组吸光度)×100％
       1.4 Hoechst33258染色检测细胞凋亡
       根据MTT实验结果，选择40 mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作为后续实验药物浓度。将干净无菌的盖玻片置于六孔板内，接种细胞过夜。当50％～80％满时，加入白花蛇舌草乙醇提取物作用12，24，36，48 h后，吸尽培养液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min。然后去固定液，用PBS洗两次，3 min/次，吸尽液体，加入0.5 ml Hoechst33258染色液（1 mg/ml），染色5 min，晃动数次，封片，荧光显微镜下观察。
       1.5 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率    
       将A549细胞接种于六孔板，待细胞生长至75％融合左右，对照组加入DMEM培养基，实验组加入白花蛇舌草乙醇提取物（40 mg/ml），作用0，12，24，36，48 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后，80％冰乙醇固定，－20℃过夜。检测前PBS冲洗细胞1次，调整细胞浓度为106 ml-1， 加入含RnaseA（终浓度为0.25 mg/ml）的碘化丙啶（PI）染色液（终浓度为5 μg/ml）中，室温避光染色30 min，流式细胞仪（购自Bechman Dickson 公司）检测，每组重复3次，Cell Quest及Motift软件分析SubG1峰和细胞周期。1.6   蛋白免疫印迹试验（Western Blot） 收集细胞，加入细胞裂解液，冰上放置15 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，以Bradford法作蛋白质定量后置－80 ℃贮存备用。灌制10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1∶500），4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，ECL显色。图像经Uvp grabit Image软件测定各条带的吸光度，以各条带的吸光度值与β-actin吸光度值的比值进行细胞间蛋白表达量的比较。
       1.7 统计学分析
       所有数据均用±s表示，使用统计软件SPSS10.0进配对资料t检验，P﹤0.05为差异有显著性意义。
       2 结 果
       2.1 白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的影响
       MTT结果显示，不同浓度的白花蛇舌草乙醇提取物均能抑制肺腺癌A549细胞的生长，药物作用效果具有较明显的的时效和量效关系（见图1）。经观察，选择40 mg/ml的药物浓度作为后续实验药物剂量。2.2   Hoechst33258染色检测结果用Hoechst33258对白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞36 h后的细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察发现，对照组活细胞所发荧光较弱，较均匀；经白花蛇舌草乙醇提取物作用36 h后发生凋亡的A549细胞核明显变小，并可见致密强荧光，可见凋亡小体。见图2 。
       2.3 白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞凋亡率和细胞周期的影响  
       40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用于A549细胞12，24，36，48 h，通过亚G1峰检测其凋亡率分别为（5.72±0.98）%，（7.10±2.08）%，（19.89±4.25）%，（32.55±6.51）%，与对照组细胞凋亡率相比，差异有显著性（P均<0.05）。细胞周期检测结果显示，40 mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞后，G1～G0期细胞百分比逐渐增高，从0 h的（36.34±5.15）%，升高到48 h的（64.94±7.56）%。结果见表1和图3。表1  40 mg/ml 白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞周期和细胞凋亡率的影响（略）
       2.4 Western Blot检测结果
       40 mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞0，12，24，36，48 h，Western Blot检测Bax的表达逐渐增加，Bcl-2的表达逐渐减低。结果见图4。
       3 讨论
        细胞凋亡是一种非常复杂的生理和病理过程，是受控于基因指导的主动性细胞自我消亡过程，是细胞固有的功能。其形态特征包括细胞固缩、染色质凝聚、边集至核膜下以及凋亡小体形成［4］。现在普遍认为，无论药物的靶点何在，多种化疗药物最终主要通过诱导肿瘤细胞凋亡或坏死而达到治疗目的［5］。
       
       祖国医药在肿瘤的综合治疗方面已经积累了许多宝贵临床经验，白花蛇舌草是临床广泛使用的抗肿瘤中药之一。其具有清热解毒、活血化淤、利尿通淋等功能。现代研究表明［6～8］，其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等，这些主要的有效成分具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。
       
       实验结果表明，白花蛇舌草乙醇提取物可在体外抑制肺腺癌A549细胞的增殖，具有明显的时效和量效关系。为了研究其对A549细胞增殖抑制的机制，我们应用流式细胞仪检测A549经药物作用后的细胞周期，发现40 mg/ml白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞12，24，36，48 h后，G1～G0期细胞百分比分别为（42.82±3.95）%，（51.84±6.37）%，（54.76±8.85）%和（64.94±7.56）%，均高于对照组（P均﹤0.05），且G1～G0期细胞百分比随药物作用时间增加而增加。结果表明，白花蛇舌草乙醇提取物作用于A549细胞主要是影响细胞周期G1～G0期向S期的转变过程，将肿瘤细胞阻滞在G1～G0期，抑制细胞增殖。
       经Hoechst33258染色及流式细胞仪检测，白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞，可诱导细胞发生凋亡，40 mg/ml白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞12，24，36，48h后，凋亡率分别为（5.72±0.98）%，（7.10±2.08）%，（19.89±4.25）%，（32.55±6.51）%，均高于对照组（P均﹤0.05），且凋亡率随药物作用时间增加而增加。凋亡的线粒体通路主要由Bcl-2家族成员所调控，该家族可分为两个亚群：一个亚群Bcl-2，Bid，Bcl-x，Bcl-w等抗凋亡蛋白组成；另一个亚群由Bax，Bak，Bik，Bcl-xs等促凋亡分子组成［9］。本实验检测了Bax和Bcl-2蛋白水平的变化情况，白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞，Bax蛋白水平逐渐表达升高，Bcl-2蛋白水平表达逐渐减低，表明凋亡是通过促凋亡分子Bax的上调和抗凋亡分子Bcl-2的下调来实现的。
       由此可见，白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549细胞增殖有抑制作用，药物作用效果具有较明显的时效和量效关系，其抑制作用可能通过将细胞周期阻滞于G1～G0期和通过上调Bax和下调Bcl-2的表达而诱导细胞凋亡来实现的。本实验中所用的乙醇提取物乃是一种混合物，其肿瘤抑制作用是由一种成分的主要起作用还是多种成分的协同起作用，有待进一步研究。
       【参考文献】
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       ［9］Cory S， Adams JM. Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch ［J］. Cancer Cell， 2005， 8(1): 5.