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       【摘要】 
       目的研究湖北贝母总生物碱对豚鼠的平喘作用及其机理。方法采用豚鼠整体动物引喘和豚鼠离体气管螺旋条的实验方法，分别研究湖北贝母总生物碱对乙酰胆碱－组胺(Ach-Histamine)整体动物的平喘作用、对离体气管平滑肌基础张力的影响及对各种致痉剂收缩气管平滑肌的抑制作用。结果湖北贝母总生物碱在4 mg/kg剂量下灌胃给药1 h后,能明显延长AchHistamine所致豚鼠哮喘的引喘潜伏期，表现出良好的平喘效应；对豚鼠离体气管平滑肌的基础张力无显著影响；对Histamine和5HT引起的收缩也无明显的抑制作用；但对于Ach引起的收缩，湖北贝母总生物碱在2.5 mg/L的浓度时即呈现出显著的抑制作用(P<0.01),对20 μmol/ L Ach的IC50为13.130 4 mg /L；湖北贝母总生物碱可使Ach量效累积曲线向右平移,而最大效应不降低。结论湖北贝母总生物碱对豚鼠具有较强的平喘作用,其机理可能与竞争性拮抗气管平滑肌M受体从而扩张气管平滑肌作用有关。
       【关键词】  湖北贝母 总生物碱 平喘 离体气管平滑肌
       Studies on the Antiasthmatic Effect and Mechanisms of the Total Alkaloids from Fritillaria hupehensis in Guinea Pigs
       XU Fangzhou，ZHANG Peng，ZHANG Yonghui，RUAN Hanli，PI Huifang，WU Jizhou
       1. Shenzhen Hospital, Peking University, Shenzhen,518036, China; 2. Faculty of Pharmacological Sciences, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the antiasthmatic effect and its mechanism of the total alkaloids from Fritillaria hupehensis in guinea pigs. MethodsWe investigated the antiasthmatic effect of the total alkaloids through observing the latent period of asthma induced by acetylcholine-histamine in guinea pigs. By measuring the tension of isolated guinea pig tracheal strips in vitro, we observed the influence of the total alkaloids from Fritillaria hupehensis both on the basal tension and the contraction induced by acetylcholine, histamine and 5-HT.Results4 mg / kg (i.g) of the total alkaloids could significantly prolong the latent period of asthma in guinea pigs. In the isolated guinea pig tracheal smooth muscle experiments, though the total alkaloids from Fritillaria hupehensis could not change the basal tension and the contraction induced by histamine and 5-HT, it could antagonize the contraction induced by acetylcholine. The IC50 was 13.130 4 mg/L. Moreover, the cumulative concentration-response curves of acetylcholine were shifted to the right in a concentration-dependent manner, and the maximal contraction was not changed significantly. ConclusionThe total alkaloids from Fritillaria hupehensis has obvious autiasthmatic effect, which may be correlated with the competitive antagonism of muscarinic receptor on guinea pig tracheal smooth muscle. The total alkaloids from Fritillaria hupehensis may be an novel and good antiasthmatic agent.
       Key words： Fritillaria hupehensi Hsiao et K. C. Hsia;   Total alkaloids;   Antiasthmatic effect;   Isolated tracheal smooth muscle
       
       中药贝母为百合科(Liliaceae)贝母属Fritillaria L.多种植物的干燥鳞茎，具有清热润肺、止咳祛痰和平喘的功效，在我国使用历史悠久，至今仍是防治呼吸系统疾病之要药。湖北贝母 Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C. Hsia 原野生于湖北省恩施自治州，俗称“板贝”或“窑贝”，民间习作川贝药用，历史悠久，现已收载于《中国药典》2000及2005版中，发展为仅次于浙贝母的第二大贝母主流品种。自1979年开始，吴继洲教授等对湖北贝母作了化学成分、急性毒性、药效学和一般药理学等品质评价的系统研究，不仅阐明了湖北贝母中主要的生物碱和非生物碱等化学成分的结构［1，2］，而且进一步的药效学研究还得出湖北贝母镇咳、祛痰和平喘的活性部位为总生物碱［3］。虽然湖北贝母的药效部位已明确为总生物碱，但对其平喘效应、平喘效应的量效关系及平喘机理尚未有研究报道。为配合湖北贝母总生物碱的新药开发，本文以乙酰胆碱－组胺引喘法研究了湖北贝母总生物碱对豚鼠的平喘效应及其量效关系，并进一步用离体气管平滑肌对其平喘的机理作了深入的探讨。
       1  材料与仪器
       1.1  试剂及药品
       氯化乙酰胆碱(上海三爱思试剂有限公司, 050209)；磷酸组胺(上海丽珠东风生物技术有限公司，040506)；5-羟色胺(ABCR Gmbh，Germany)；0.9%氯化钠注射液(武汉滨湖双鹤药业有限公司，050815)；氨茶碱注射液（常州兰陵制药有限公司，0508091）；吲哚美辛(山西临汾云鹏药业有限公司)；湖北贝母总生物碱由本教研室提供；其他试剂均为国产分析纯；Krebs-Henseleit 营养液组成如下（mmol/L）：NaCl 118.4，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25，Glucose 11.1。加蒸馏水至1 000 ml并调节pH至7.4。
       1.2 仪器
       402AI型超声喷雾仪（江苏鱼跃医疗器械有限公司）；高灵敏度肌肉张力换能器(JZJ01H型，四川成都仪器厂)；RM6240BD型多道生理记录仪、HSS1B型超级恒温器及麦氏恒温浴槽(四川成都仪器厂)。
       1.3 动物豚鼠，体重(170±20) g，雌雄兼用；豚鼠，雄性，体重（300±50）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
       2 方法
       2.1 乙酰胆碱
       组胺整体动物引喘实验［4］取(170±20) g的豚鼠，雌雄不拘，逐一测定引喘潜伏期，挑选合格者。将豚鼠放入密封透明塑料盒中，以402AI型超声喷雾仪恒速喷入2%氯化乙酰胆碱和0.1%磷酸组胺的等量混合液15 s，密切注意豚鼠的反应。观察6 min之内豚鼠出现喘息性抽搐的潜伏期即引喘潜伏期与发生抽搐的动物数，如见豚鼠跌倒应立即将其取出，以免死亡。并记录引喘潜伏期，若引喘潜伏期大于120 s则认为不合格而不予选用。次日将合格豚鼠随机分组，每组8只。分别ig给予阴性对照生理盐水、氨茶碱和不同剂量的湖北贝母总生物碱，给药60 min后，以同样条件引喘并测定引喘潜伏期。计算给药前后豚鼠引喘潜伏期的差值。
       2.2 豚鼠离体气管平滑肌实验［4］
       2.2.1 标本制备
       击毙豚鼠，迅速取出气管，放入通有5%CO2和95%O2的Krebs-Henseleit营养液中，轻柔去除气管周围的疏松结缔组织后，剪成宽约3～5 mm、长约20 mm的螺旋条。迅速置于盛有5 ml营养液并持续通以5%CO2和95%O2的麦氏恒温浴槽中(37.2℃)，气管螺旋条上端接肌肉张力换能器，标本前负荷为3.0 g。采用RM6240BD型四道生理记录仪记录气管平滑肌肌张力的变化，每15 min换液1次，平衡2 h后开始实验，实验前用低浓度的Ach预收缩2～3次。在正式实验中，每次换液均同时加入吲哚美辛2 μmol/L，以抑制环加氧酶，消除PGS对标本的影响。每次实验结束后充分冲洗，待基线稳定后再开始下一个实验。
       2.2.2 对气管平滑肌基础张力的影响
       气管螺旋条经平衡后，在浴槽中加入不同量的湖北贝母总生物碱，使其浓度分别为5，10，20，40，80 mg/L，记录各给药浓度下气管螺旋条张力的变化，同时以氨茶碱作阳性对照。
       2.2.3 对Ach引起气管平滑肌收缩反应的影响
       
       IC50的测定：气管螺旋条平衡后，在浴槽中加入Ach，使其浓度达到20 μmol/L，待气管条收缩达到峰值并稳定后，用累积加药法分别在不同浴槽中加入湖北贝母总生物碱，使其浓度分别达到2.5，5，10，20，40 mg/L，记录不同浓度下气管螺旋条相对应的张力值，以未加药时引起的最大张力为100%来计算各浓度下药物对应的抑制率，同时以空白溶剂作对照，计算各药物对Ach的IC50值。
       
       对Ach量效累积曲线的影响：气管螺旋条在KrebsHenseleit营养液中平衡2 h后，即以累积浓度法加入Ach，建立Ach的量效累积曲线。然后每间隔15 min冲洗3次，待基线平衡稳定在原来水平后，再依次加入不同剂量的湖北贝母总生物碱，温育30 min后重复建立Ach的量效累积曲线, 观察曲线的最大效应是否降低。
       2.2.4 对炎性介质Histamine和5HT引起气管平滑肌收缩反应的影响
       气管螺旋条经平衡后，分别在浴槽中加入20 μmol/L的Histamine和5HT，待气管条收缩达到峰值后，用累积加药法分别在不同浴槽中加入不同浓度的湖北贝母总生物碱，记录不同浓度下气管条相应的张力值。
       3 结果
       3.1 整体平喘效果
       如表1所示，湖北贝母总生物碱在4 mg/kg的剂量下能够显著地延长乙酰胆碱组胺所致豚鼠哮喘的引喘潜伏期（P<0.01），其平喘效应与所给剂量之间存在量效依赖关系。
       3.2 对离体气管平滑肌基础张力的影响
       湖北贝母总生物碱的给药浓度为5，10，20，40 mg/L时将使气管平滑肌基础张力稍有增加，但与给药前的张力无统计差异，而给予氨茶碱20 mg/L时即可使气管平滑肌的张力下降（510 ± 80） mg，由此可以认为湖北贝母总生物碱对豚鼠离体气管平滑肌基础张力无明显影响。见图1。表1  湖北贝母总生物碱的平喘效应（略）
       3.3 对Ach引起气管平滑肌收缩反应的影响
       3.3.1  IC50的测定结果
       20 μmol/L的Ach可引起气管平滑肌迅速收缩，阴性对照组收缩达峰值后可维持30 min之内保持不变，累加浓度法加入不同浓度的湖北贝母总生物碱对Ach引起的气管螺旋条收缩呈现剂量依赖的拮抗效应，如表2 所示，其对20 μmol/L的Ach的IC50值为13.130 4 mg / L。表2  湖北贝母总生物碱对Ach引发豚鼠离体气管平滑肌收缩的抑制作用（略）
       3.3.2 对Ach量效累积曲线的影响
       湖北贝母总生物碱对Ach量效累积曲线的影响如图2所示，随着总生物碱浓度的增加，Ach的量效曲线右移，但最大效应并不降低，呈现出竞争性拮抗Ach的效应。
       3.4 对炎性介质Histamine和5HT收缩气管的作用
       Histamine (20 μmol/L)可引起气管条平滑肌迅速的收缩,空白溶剂组对Histamine 和5-HT引起的气管平滑肌收缩无明显影响，湖北贝母总生物碱达80 mg/L时对Histamine 和5-HT引起气管螺旋条收缩仍无明显抑制作用。
       4 讨论
          
       上述研究结果表明，湖北贝母总生物碱对乙酰胆碱-组胺引喘的豚鼠具有显著的平喘作用，由离体实验的结果来看，其作用机理可能与竞争性拮抗气管平滑肌上的M受体相关。
       
       哮喘是一种以气道炎症和气道高反应性为特征的疾病，其发病机理相当复杂，往往是多种介质或细胞因子共同作用的结果。目前对于哮喘的治疗主要集中在扩张支气管和抗炎两个方面［5］，其中扩张支气管的药物主要有M-受体拮抗剂和β2-受体激动剂两大类药物［6］，由于在气道的全部平滑肌上均有胆碱能神经纤维和胆碱能受体分布，各种刺激引起的内源性乙酰胆碱释放在诱发哮喘中有重要作用［7］，且对于老年哮喘特别是合并慢性支气管炎、肺气肿者，应用胆碱能M-受体阻滞剂, 其效果优于β2-受体激动剂，这是由于老年支气管哮喘患者气管平滑肌β2-肾上腺素能受体数量减少，敏感性降低所致，所以，对于使用β2-受体激动剂类药物疗效欠佳的老年支气管哮喘患者，在临床上较为主张应用M-受体拮抗剂进行治疗［8］。湖北贝母总生物碱能够竞争性拮抗乙酰胆碱引起的气管痉挛，而且相对于哮喘治疗中常用的M受体拮抗剂来说，它具有镇咳和祛痰的效应［3］，这对于合并有咳嗽和痰多的老年支气管哮喘患者尤为适宜。本研究为湖北贝母总生物碱在治疗咳、痰、喘等疾病提供了良好的理论依据。
       【参考文献】
         　　［1］阮汉利, 吴继洲, 姚念环. 湖北贝母二萜聚合物的结构研究［J］. 中草药, 2001, 31(2)： 110.
       
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       ［3］张勇惠, 阮汉利, 曾凡波, 等. 湖北贝母镇咳、祛痰、平喘药效部位的筛选［J］. 中草药, 2003, 34(11)：1016.
       
       ［4］徐叔云, 卞如濂, 陈 修. 药理实验方法学，第3版［M］. 北京: 人民卫生出版社, 2002：1370,1380.
       
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       ［6］Andreas P, Artur B, Ursula P, et al. Synergistic effects of the anti-cholinergic R, R-glycopyrrolate with anti-inflammatory drugs ［J］. Biochem Pharmaco, 2006,72：1690.
       
       ［7］Ignaz K, Wessler, Charles J.K. The Non-neuronal Cholinergic System: an Emerging Drug Target in the Airways ［J］. Pulm Pharmacol Ther, 2001, 14：423.
       
       ［8］何权瀛. 老年支气管哮喘诊断治疗中的几个问题［J］. 中华老年医学杂志, 2000, 19（8）： 247.