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       【摘要】 
       目的观察化淤祛湿法对膝骨性关节炎早期诱导型一氧化氮合酶（iNOS）炎症途径的影响,探讨其治疗作用机理。方法通过切断膝关节前交叉韧带和内侧副韧带造成膝OA模型。将24只日本雄性大耳白兔随机分为A组（正常组）、B组（模型组）、C组（补肾法）、D组（化淤祛湿法）。给药4周后处死实验兔，行关节腔大体观察，关节液NO含量检测，滑膜、关节软骨组织学观察，滑膜、关节软骨iNOS含量检测。结果D组关节腔大体观察与C组比较，差异无显著性(P>0.05)；D组关节液NO含量检测与C组比较，差异显著(P<0.05)；D组滑膜、关节软骨组织学观察评分与C组比较，差异显著(P<0.05)；D组滑膜组织及软骨中iNOS含量与C组比较有显著性差异(P<0.05)。结论化淤祛湿法通过抑制膝OA早期NO及iNOS的表达，可降低NO及iNOS含量，减少软骨细胞凋亡，促进软骨基质合成及抑制其分解，抑制滑膜炎症，延缓关节软骨退变，促进了关节软骨的修复。
       【关键词】  膝骨关节炎 化瘀祛湿法 一氧化氮合酶
       膝关节骨关节炎（简称膝骨关节炎，KOA）是一种多发于老年人的慢性退行性疾病，目前无根治方法，现代医学采用非甾体类消炎镇痛药（NSAIDs）为主对症治疗。而长期使用NSAIDs ，易发生胃肠道溃疡等严重并发症。临床应用化淤祛湿法或类似治法治疗KOA取得了较好疗效［1～6］。我们在兔KOA早期动物模型上，观察了化淤祛湿法对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）炎症途径的影响，以探讨化淤祛湿法对KOA早期的治疗作用及其机制，为临床应用提供依据。
       1 材料
       1.1 分组
        
       选择成年健康日本雄性大耳白兔24只（广西中医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK桂2003-0001），体重2.0～2.5kg。按随机数字表法随机分成4组：A组（正常组）、B组（模型组）、C组（补肾法）、D组（化淤祛湿法），每组6只，分别编号。
       1.2 造模与处理 
       手术切断膝关节前交叉韧带和内侧副韧带制造兔膝骨关节炎软骨退行性变模型。采用化学纯氨基甲酸乙酯（乌拉坦）麻醉，用0.9%盐水将其配成25%的溶液，按1 g·kg-1体重（4 ml·kg-1体重）耳缘静脉注射。麻醉后，剪除右后肢膝关节周围毛发，常规消毒，髌旁内侧切口长约3 cm，切开关节囊，将髌骨向外翻转，切断前交叉韧带和内侧副韧带，止血，缝合关节囊及皮肤。A组不手术。4周以后喂服药物1次/d，连续给药4周。A组与B组喂服与D组中药等量的淀粉颗粒1次/d。药物组与剂量：①C组：桑寄生15 g，补骨脂10 g，杜仲10 g，肉苁蓉10 g，熟地10 g，鹿含草10 g，续断15 g，山茱萸10 g；②D组：丹参15 g，当归10 g，川芎10 g，红花10 g，川牛膝10 g，苍术15 g，半夏10 g，陈皮10 g，白芥子6 g，白术10 g。为提高实验结果的重复性，使用由江阴天江药业有限公司生产的单味中药浓缩颗粒剂组配，并且要求同一批号。用药剂量按Meeh-Rubner公式A(体表面积)=K(系数)·W(体重g)2/3·10-4体表面积换算，用适量温开水将中药浓缩颗粒剂搅拌均匀后灌胃。动物分笼标准饲养。于手术后8周予过量麻醉处死，处死当天不给药。处死后每只动物依次打开关节腔行大体观察。用锐刀切取内侧滑膜和股骨内髁下面全层关节软骨，留作实验标本。滑膜、软骨标本分成两等份。
       2 方法
       2.1 关节腔大体观察 
       实验动物处死后，打开膝关节囊，观察滑膜和软骨表面的颜色、光泽、光滑度（是否粗糙）。
       2.2 关节液NO含量测定 
       打开膝关节囊后，收集关节滑液0.5 ml，用等量生理盐水稀释后，严格按南京建成生物研究所提供的NO测试盒（编号20071211）的实验步骤行NO含量测定。
       2.3 组织学观察 
       取材后的滑膜和软骨标本经4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，递增浓度乙醇脱水，石蜡包埋，与滑膜或软骨表面垂直行间断连续切片，厚3 μm。HE染色、光镜下组织学观察。
       2.3.1 滑膜组织学观察 
       观察滑膜细胞、细胞外基质、毛细血管。将滑膜病变定为4级，计分为0～3分。滑膜完整，细胞排列整齐，无充血水肿、无炎细胞浸润为0级，计0分；滑膜充血水肿，表层细胞增生为Ⅰ级，计1分；滑膜细胞呈乳头状增生，滑膜内血管增生，肉芽组织形成为Ⅱ级，计2分；滑膜内肉芽组织纤维化（瘢痕形成），伴有淋巴细胞和浆细胞浸润为Ⅲ级，计3分。
       2.3.2 软骨组织学观察 
       观察的石蜡切片HE染色：观察软骨表面，细胞排列，基质，潮线。按照贺艳丽等［7］标准，予适当简化，将软骨退变定为4级，计分为0～3分。关节软骨表面光滑，可清楚地分为表层、移行层、辐射层和软骨基质钙化层，辐射层和钙化层之间的潮线清晰可见为0级，计0分；软骨细胞排列不规则，层次变得紊乱为Ⅰ级，计1分；软骨中层内有软骨细胞成簇增生，潮线间断为Ⅱ级，计2分；关节软骨表层灶性剥离，层次紊乱，潮线消失为Ⅲ级，计3分。
       2.4 滑膜、软骨iNOS检测 
       软骨和滑膜组织中iNOS含量测定：剥取关节内滑膜及关节软骨，用1/10万电子天平精确称重，立即于低温下(-83℃)放置，用研钵粗研后，用组织匀浆器做成组织匀浆，12 000 r/min离心后取上清液，严格按南京建成生物研究所提供的iNOS测试盒（编号20071211）的实验步骤行iNOS含量测定。
       2. 5 统计方法 
       本研究的数据以±s表示。采用SPSS11.0 for Windows统计软件进行数据录入和统计处理。
       3 结果
       3.1 滑膜和软骨大体观察A组兔膝关节软骨外观呈蓝白色，色泽明亮，无裂纹及软化缺损，触之较硬；关节液量较少，质地清辙透明。B组关节软骨明显失去原有光泽、发黄、色泽暗淡、软骨触之较软，尤以股骨外髁为著，可见皲裂甚至缺损，关节表面欠规则，且关节边缘有骨赘形成及纤维性粘连，滑膜存在不同程度增生；关节液量增多，且呈泡沫状、混浊。对照、治疗两组均可见关节软骨外观呈白色，欠光滑，股骨髁软骨触之变软，有的可见裂纹，滑膜轻度增生，关节液较A组稍多。D组肉眼观察与C组相似，滑膜炎性表现较B组轻，C，D组之间差异不显著。
       3.2 关节液NO含量测定  见表1。关节液NO含量，B组与A组比较明显升高，有显著性差异(P<0.05)；C组及D组NO含量与A组比较无显著性差异(P>0.05)，但与B组比较均明显降低，有显著性差异(P<0.05)，且D组NO含量降低较C组明显，有显著性差异(P<0.05)。提示B组关节液NO含量显著升高，使用补肾法和化淤祛湿法均可降低关节液NO含量，两种药物比较，化淤祛湿法作用更加明显。
       3.3 组织学观察
       3.3.1 滑膜组织学观察 
       见表1。滑膜组织学计分，B组与A组比较明显升高，有显著性差异(P<0.05)；C组与A组比较有显著性差异(P<0.05)，而与B组比较明显降低，有显著性差异(P<0.05)；D组与A组比较无显著性差异(P>0.05)，D组与B组比较有显著性差异(P<0.05)，D组与C组比较有显著性差异(P<0.05)。提示膝OA早期兔模型中，使用化瘀祛湿法和补肾法均有利于减小滑膜组织学计分，抑制滑膜炎症；但两种方法比较，化淤祛湿法作用更加明显。
       3.3.2 关节软骨组织学观察 
       见表1。关节软骨组织学计分，B组与A组比较明显升高，有显著性差异(P<0.05)；C组与A组比较有显著性差异(P<0.05)，而与B组比较明显降低，有显著性差异(P<0.05)；D组与A组比较无显著性差异(P>0.05)，D组与B组比较有显著性差异(P<0.05)，D组与C组比较有显著性差异(P<0.05)。提示膝OA早期兔模型中，应用化淤祛湿法和补肾法均可延缓关节软骨退变；但两种方法比较，使用化淤祛湿法更优于补肾法。
       3.4 滑膜、软骨iNOS的检测
        
       见表1。关节滑膜和软骨iNOS含量，B组与A组比较明显升高，有显著性差异(P<0.05)；C组与A组比较有显著性差异(P<0.05)，而与B组比较明显降低，有显著性差异(P<0.05)；D组与A组比较无显著性差异(P>0.05)，D组与B组比较有显著性差异(P<0.05)，D组与C组比较有显著性差异(P<0.05)。提示膝OA早期兔模型中，使用化淤祛湿法和补肾法均可降低滑膜和关节软骨iNOS的表达；但两种方法比较，而使用化淤祛湿法更优于补肾法。表1  关节液NO含量、滑膜和软骨病变计分、软骨和滑膜iNOS含量（略）
       ①关节液NO含量：B组与A组相比较，P<0.05；C组、D组与A组相比较，P＞0.05；C组、D组与B组相比较，P＜0.05；D组与C组相比较，P＜0.05；②滑膜病变计分：B组与A组相比较，P＜0.05；C组与A组相比较，P＜0.05；C组与B组相比较，P＜0.05；D组与A组相比较，P＞0.05；D组与B组，C组相比较，P＜0.05；③软骨病变计分：B组与A组比较，P＜0.05；C组与A组相比较，P＜0.05；C组与B组相比较，P＜0.05；D组与A组相比较，P＞0.05；D组与B组、C组相比较，P＜0.05；④滑膜iNOS含量和软骨iNOS含量：B组与A组相比较，P＜0.05；C组与A组相比较，P＜0.05；C组与B组相比较，P＜0.05，D组与A组相比较，P＞0.05；D组与B组、C组相比较，P＜0.05；n=6
       4 讨论
       中医学认为，KOA多责之于虚实两端，虚以肝肾脾亏虚等为主，实以血淤、痰湿阻滞等为主。病性为本虚标实。我们认为［8］，本病虽虚实夹杂，证候复杂，但淤、湿（痰）等标实是造成KOA疼痛、肿胀等症状的主要原因， KOA的早期更是以实证为主，而虚证不突出。采用化瘀祛湿法治疗早期KOA，切中中医病机；即使兼有虚证，暂不治之，也符合中医“急则治其标”原则。
       
       研究发现，OA的发病与NO和iNOS密切相关。在正常滑膜中iNOS未见明显表达［9］，OA时细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)等刺激下，使滑膜细胞表达iNOS增加，且iNOS强烈表达于沿膜衬里层、滑膜下层［10］。一旦iNOS蛋白合成，它的活性可持续表达，能催化产生大量NO，使NO水平升高，软骨分解代谢增快，软骨细胞凋亡过盛，最致导终关节软骨损害。因此，iNOS在OA的发病过中发挥着重要作用。本研究结果显示实验各组关节液中NO含量明显增高，也提示NO是OA软骨退变的机制之一。
       在OA的早期，滑膜的增生和纤维化，分泌炎症介质和软骨降解酶，且参与OA整个病理过程［11］，而且滑膜组织学改变与OA的临床表现也呈现出相符性［12］。实验显示，使用化淤祛湿法可减少KOA早期关节液中NO的含量、滑膜和关节软骨中iNOS的表达，显著降低关节局部NO的含量，从而有利于抑制滑膜炎症，缓解KOA早期的疼痛、肿胀症状，延缓关节软骨的退变。
       
       本实验表明，化淤祛湿法对兔KOA早期iNOS炎症途径产生重要作用，为化淤祛湿法的临床应用提供了依据。
       【参考文献】
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