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       【摘要】 
       目的探讨苦竹叶中总黄酮的提取、 鉴别方法及对羟自由基的清除能力，以充分利用苦竹叶植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从苦竹叶中提取黄酮类化合物，用分光光度法测定黄酮类化合物的总含量，并利用对羟自由基的清除能力就苦竹叶总黄酮的抗氧化性进行研究。结果测得样品中黄酮类化合物的总含量为C=0.407 mg/ml，回收率为100.5%，其纯度和产率均较高。结论该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取苦竹叶中黄酮类化合物的有效途径。苦竹叶黄酮类化合物提取液对 Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除作用。
       【关键词】  苦竹叶 总黄酮 鉴别 超声波提取 清除 自由基
       Extraction of Total Flavanone from Pleioblastus amarus Leaves by Ultrasonic and its Antioxidation Effect
       HUANG Hongying，DENG Bin,JIANG Gangbiao   
       1.Department of Chemistry and Life Science,Xiangnan University,Chenzhou 423000,China;2.Department of Pharmaceutical Engineering of South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China
       Abstract：ObjectiveTo study the extraction and identification of total flavanone from Pleioblastus amarus leaves and its effect of scavenging hydroxyl radical. MethodsThe flavonoids were extracted from pleioblastus amarus leaves with ultrasonic wave and ethanol extraction. Spectrophotometry was used to determine the flavanone content of Pleioblastus amarus leaves. The effect of scavenging hydroxyl radicals of total flavanone from Pleioblastus amarus leaves was also studied.ResultsBy this method, the content of the total flavanone of Pleioblastus amarus leaves was C=0.407mg/ml and the recovery rate was 100.5%. ConclusionThis text provides the extraction and purifying methods to get the outcome and the purity of the flavanone is high. This method is a purely physical process and has no pollution. It is an ideal way to extract the total flavanone of Pleioblastus amarus Leaves. Total flavanone from Pleioblastus amarus leaves have scavenging effects on hydroxyl radicals.
       Key words： Pleioblastus amarus leaves;  Total flavanone; Identification; Ultrasonic wave treatment; Scavenging;  Free radicals
       
       苦竹Pleioblastus amarus Keng f.是一种乔本科竹亚科多年生常绿植物，高达几米至十几米，常生长在山谷平原或向阳山坡，在我国南方各省市分布广泛。苦竹用途广泛［1］，竹笋、秆、皮、根等均已被开发利用［2，3］，但苦竹叶多被废弃。据《本草纲目》记载，苦竹叶味苦，性凉，无毒。具有医治口疮目痛，明目利九窍，治不睡，止消渴，解酒毒，发汗，中风暗哑等［4］功效。新近研究成果表明，苦竹叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖及其他有效成分［5］。黄酮类化合物有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂和镇痛等生理作用，还具有较强的清除生物体内超氧自由基的作用等［6］。苦竹叶黄酮以其巨大的资源优势，良好的药理活性和极低的毒副作用，必将成为一种极具开发价值的新型中草药［7］。目前，有关提取苦竹叶黄酮的方法［8］存在提取时间长、溶剂消耗大、提取率低等缺点而超声提取技术利用超声波辐射产生的多种作用，可极大地提高提取效率，节约溶剂，同时还可避免高温对提取成分的影响［9］。为此，本文首次将超声技术用于苦竹叶总黄酮的提取当中，同时对黄酮提取物进行体外抗氧化性研究，为大规模提取、开发黄酮类化合物及综合利用苦竹叶资源提供理论和实验依据。
       1  仪器与材料
       TU-1800紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司生产)； SK2200H型超声波清洗仪 (上海科导超声仪器有限公司生产)；SHB-III循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)；DZK88-A型热恒温真空干燥箱 (上海医疗器械七厂生产)；AB-1042型电子分析天平 (梅特勒-托利多上海仪器有限公司)。
       
       双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、95%乙醇、氢氧化钠、三氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、醋酸乙酯、乙酸镁、甲醇、盐酸、氨水、冰醋酸、正丁醇、镁粉等试剂，均为分析纯，并由西安市试剂厂提供。
       芦丁标准品 (中国药品生物制品检定所)；新鲜苦竹叶采自湖南永州市双牌县阳明山苦竹种植基地。
       2 方法与结果
       2.1 总黄酮成分提取
       将苦竹叶洗净烘干，粉碎，过20目筛，精确称取苦竹叶粉末10 g，加100 ml 95%乙醇，超声波提取2.0 h，抽滤。滤渣再加100 ml 95%乙醇，超声波继续提取2.0 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩20 ml左右为止，置250 ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，即得样品液。
       2.2 测定方法
       以芦丁为对照品测定苦竹叶中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。
       2.3 定量实验-总黄酮的含量测定
       2.3.1 测定波长的选择 
       精确量取一定量的样品液，在碱性条件下，加入0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液，在420～700 nm波长范围测定络合物的吸光度，结果表明络合物在510 nm波长处有最大吸收峰出现，故测定时选用此波长为特征吸收峰位置。
       2.3.2 标准曲线的制作
       精密称取芦丁20 mg，加60%乙醇水溶液定容至100 ml，从中取出25 ml并且用蒸馏水稀释至50 ml。再分别吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 ml于10.00 ml具塞试管中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝水溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠水溶液4.00 ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置 15 min后，以试剂为空白，在510 nm处测吸光度。结果见表1。表1  紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度（略）
       根据表1可得芦丁浓度(C)与其吸光度(A)具有良好的线性关系，其线性方程式为：
       A= 11.210 0C- 0. 002 9, ( r=0. 999 9) 
       2.3.3  提取物含量的测定精密吸取样品液1.0 ml，置 10 ml容量瓶，按标准曲线的制备方法测其吸光度为A=0.454，根据回归方程： A=11.210 0C- 0.002 9，计算出样品中总黄酮的含量为C=0.407 mg/ml。
       2.3.4 回收率实验精密量取样品液2.00 ml，加入标准芦丁对照品2.00 ml (0.125 mg/ml)，同前样品测定方法操作测定吸光度，求得的回收率为100.5%。
       2.4 定性实验-总黄酮的鉴别
       2.4.1 颜色反应三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。
       
       盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1ml于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴 (1次加入)，在泡沫处呈紫红色。
       
       紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。
       
       乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。
       
       浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。
       2.4.2 纸层析取样品溶液15 μl点在滤纸上。用正丁醇∶乙酸∶水= 4∶1∶5(体积比)为展开剂，上行展开6 h，取出晾干，喷1%氯化铝乙醇溶液，吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。
       2.5 总黄酮提取物对·OH的清除作用 羟自由基是对机体危害最大的自由基，是氧化性极强的氧化剂，它不仅是膜脂质过氧化的罪魁祸首，而且还一直被认为是引起DNA损伤的重要因素。实验时常Fenton反应产生·OH， 反应使用的H2O2量与产生的·OH量成正比，当给予电子受体后，用试剂显色形成红色物质，其呈色程度又与·OH量成正比。因此可利用Fenton反应机理建立反应体系模型［10］，利用H2O2与 Fe2+混合产生·OH，若在反应体系中加入水杨酸，就可有效地捕捉·OH，并产生有色产物，该反应的方程式可描述如下：
       
       H2O2+Fe2+→Fe3++·OH+OH-
       所得产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入同样具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少。实验时采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系( 8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/L Fe2+ l ml，9mmol/L 1ml水杨酸-乙醇溶液 )中加入一系列不同浓度的苦竹叶总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液进行比较，在510nm处测量不同浓度下的吸光度，便可测定出被测物(总黄酮 )对·OH的清除作用，其清除率计算公式如下：
       
       清除率（％）＝A0-AxA0×100％
       其中，Ao为空白对照液的吸光度，Ax为加入不同浓度的苦竹叶总黄酮提取液的吸光度。
       以实验的提取液总黄酮作为待试样品，分别取不同体积的提取液定容到 10 ml，并分别测其对·OH的清除作用，结果见图1所示。
       
       从图1中可看出，苦竹叶总黄酮提取液对由 Fenton体系产生的·OH有很好的清除作用，随着苦竹叶总黄酮提取液浓度的上升，对·OH自由基的清除能力也随之增强，说明苦竹叶中黄酮类物质有很好的清除羟基自由基的能力和正线关系。
       3 讨论
          
       实验结果表明，超声波辅助提取苦竹叶黄酮类物质的方法，所得产品纯度高，回收率为100.5%。与常规乙醇提取法相比，超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，而且新方法采用全物理过程，无任何污染，工艺过程简单，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。
       
       黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮醇和黄酮，其余结构还包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等［6］。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，进入脂肪组织，进而表现出诸多功能，如消除疲劳、保护血管、防止动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞等等。因此黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效［11，12］。近年来，世界各地掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点备受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目，苦竹叶分布广泛。本文实验结果表明，苦竹叶中不仅含有丰富的黄酮类化合物，而且其内含的黄酮物质对羟自由基具有很好的清除能力。因此，苦竹叶具有广泛开发和利用价值，值得加强资源开发和综合利用。
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