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       【摘要】 
       目的观察马齿苋合剂水提液对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的抑制作用。方法马齿苋水提液作用于Hep-2、Vero细胞和原代兔肾(PRK)3种细胞上研究其抗病毒作用。结果马齿苋合剂水提液在Hep-2、Vero细胞和PRK细胞上均有明显的抗HSV-2作用，对HSV-2的最小有效浓度(MTC)为0.5 mg／ml，而且毒性低，最大无毒浓度(TDO)为12mg／ml，治疗指数(TI)为30.0，并有直接杀灭HSV-2的作用。结论马齿苋合剂水提液具有抗HSV-2作用。
       【关键词】  马齿苋合剂水提液 单纯疱疹病毒2型
       Experimental Studies on Anti-HSV-2 Effect of Purslane Misture Water Extract
       LIU Jianguo，YU Guohua，LIAO Yan,ZENG Yichun
       Jiangxi High Training School of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou,Jiangxi，344000, China
       Abstract：ObjectiveTo study the inhibitive effect of Purslane misture water extract on HSV-2．MethodsThe anti-virus effect was observed on Hep-2，Vero and PRK cells after treated with Purslane misture water extract.ResultsThe water extract from Purslane misture possessed distinct anti-HSV-2 effect．The MTC was 0.5 mg／ml，TDO was 12 mg／ml，and TI was 30.0．It possessed low toxicity and direct killing-virus effect on HSV-2．ConclusionPurslane misture water extract possesses anti-HSV-2 effect．
       Key words：Purslane misture water extract；  Herpes simplex virus2(HSV-2);  Experimental study
       
       HSV-2是一种常见的传染性病原体，可引起生殖道疱疹、病毒性脑炎等多种疾病，而且是宫颈癌的协同诱因。马齿苋Portulaca"oleracea L．又名马齿草(《雷公炮炙论》)，马苋(《本草经集注》)，长命菜(《中国药用植物图鉴》),为马齿苋科植物马齿苋的全草，生于田野路边及庭院废墟等向阳处，分布于全国大部分地区。国内对马齿苋的研究［1］多集中于马齿苋的化学成分和抗菌作用的研究,但有关马齿苋合剂水提液的抗病毒实验研究很少。本文对马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的药效进行了实验研究。现报道如下。
       1 材料
       1.1  细胞
        
       Hep-2、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和原代兔肾细胞（PRK）3种细胞引自江西省卫生防疫站，均用Eagle培养基传代培养。PRK取自10 d内的乳兔，常规方法制备细胞，用5％乳蛋白水解物培养。
       1.2 病毒 
       HSV-2 333株由南昌大学医学院病毒研究所提供，Vero细胞于RPMI-1640基础培养液中加入10％的新生牛血清，100 U／ml青霉素，100 μg／ml链霉素，置5％CO2孵箱中37℃ 培养，3d传代1次。滴度为TCID50=105，实验用103 TCID50／ml。
       1.3 药物
       马齿苋(购于江西中医药高等专科学院附属医院中药房)40 g，配合黄芪60 g，放入500 ml三角烧瓶，加入双蒸水200 ml浸泡过液，经水连续提取3次，合并3次提取液共400 ml，56℃水浴浓缩至100 ml，抽滤除菌，分装小瓶放-20℃ 冰箱保存备用。无环鸟苷滴眼液(ACV) (湖北潜江制药股份有限公司生产，批号H19993456)，用Hank"s稀释成不同浓度，放置冰箱保存备用。
       2 方法
       2.1 细胞毒性实验 
       将已长满单层的Hep-2细胞、Vero细胞和PRK去生长液，换成含2％小牛血清的MEM维持液，每瓶细胞分别加入不同浓度的马齿苋合剂水提液(0.5～12 mg／m1)0.1 ml，每一浓度的药物均重复4瓶，并设未加药物的细胞做正常对照。置37℃培养箱中培养l44 h，每天观察细胞的变化情况，并记录结果。
       2.2 病毒感染性滴度的测定 
       将不同稀释度的HSV-2接种细胞，每管0.1 ml，每个稀释度4瓶，37℃吸附1 h，弃上清液，加2％小牛血清的MEM培养液1 ml，置37℃培养，每日检查病毒生长情况，观察特征性细胞病毒(CPE)，7 d后记录结果。CPE记录方法：“-”为无CPE；“±”为可疑；“+”为25％的细胞出现CPE；“++”为50％的细胞出现CPE；“+++”为75％的细胞出现CPE；“++++”为100％的细胞出现CPE。
       2.3 药物体外对病毒增殖的抑制作用 
       将病毒接种于已长满单层的细胞瓶上，每瓶接种103TCID50／ml HSV-2病毒液0.1 ml，37℃ 吸附1 h，弃上清液后，Hank"s液洗3次，每一瓶加入含不同浓度的药物0.1 ml，加维持液0.9 ml，每个浓度药物均重复4瓶，并设置未加药物的病毒对照和细胞对照。然后置37℃培养箱中培养。每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果，使病变减少两个“+”为有效。
       2.4 药物对病毒的直接杀伤作用 
       将不同浓度的药物与103TCID50／ml病毒液等量混合后于37℃培养12，24，48和96 h后，将混合液分别接种长满单层的瓶内，每一浓度的药物均重复接种4瓶，每瓶接种0.2 ml，放37℃吸附1 h，用Hank"s液洗3次，加维持液1 ml，置37℃培养箱中培养。同时做细胞对照、阴性对照、病毒对照，放37℃培养12，24，48 h和96 h后观察并记录结果。
       2.5 药物对病毒感染的阻断作用 
       将不同浓度的药物加入细胞瓶内，置37℃作用48 h和72 h，弃上清液，用Hank"s液洗3次，然后接种103 TCID50／ml病毒0.1 ml，37℃ 吸附1 h，用Hank"s液洗3次，加2％小牛血清的维持液1 ml，置37℃培养箱中培养96 h观察结果。每一实验均设细胞对照、病毒对照、药物对照及阳性对照。结果判定：如果细胞对照生长良好，加药物的细胞不出现细胞病变(CPE)，说明药物能抑制病毒增殖，即药物有抗病毒作用；否则，无抗病毒作用；当病毒对照达到“++++”判定结果，以能抑制50％细胞产生病变的药物浓度为有效抑制病毒浓度。
       3 结果
       3.1 药物毒性实验
       用Hank"s液将马齿苋合剂水提液稀释为0.50，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0，10.0，12.0 mg／ml，分别加入Hep-2细胞、Vero细胞和PRK中，培养144 h后，细胞形态规则，排列紧密有序，每一浓度组对每种细胞均无毒性作用，最大无毒剂量12 mg／ml。结果见表1。表1  马齿苋水提液的细胞毒性和CPE的抑制作用（略）
       3.2 马齿苋合剂水提液对病毒所致的细胞病变(CPE)的抑制作用 
       当病毒对照达到“++++”时，药物浓度≥0.5 mg／ml时，药物对HSV-2所致的CPE有抑制作用，细胞形态良好，只有个别衰老细胞，最小有效剂量为0.5 mg／ml，该药抗病毒指数为30，在每种细胞上药物对病毒的作用程度一致，提示该药物的抗病毒作用无细胞差异。结果见表1。
       3.3 药物的直接杀伤作用
       将不同浓度的药物与103TCID50／ml的HSV-2悬液等量混合，作用12 h、24 h和48 h后，将其接种到长满单层细胞的瓶内，培养96 h后观察发现，作用24 h组混合液细胞形态良好，排列规则，仅有少量的衰老细胞；作用12 h组有较轻的CPE出现；病毒对照组出现明显的CPE(++++)，细胞变大脱落，细胞内颗粒物增多。由此可见，马齿苋合剂水提液有直接杀伤HSV-2的作用。结果见表2。表2  马齿苋水提液对病毒的直接杀伤作用和阻断作用（略）
       3.4 药物对病毒感染的阻断作用
       马齿苋合剂水提液在大于2.0 mg／ml时具有阻断病毒作用，而低浓度的药物则阻断作用不明显,且≥5.0 mg／ml阻断作用消失。
       其结果表明，马齿苋合剂水提液体外有明显的抗单纯疱疹病毒的作用，0.5 mg／ml时能够抑制病毒所致CPE的产生和对病毒有直接杀伤作用。
       4 讨论
             
       目前抗HSV的首选药物为无环鸟苷(ACV)，其分子基础为作用于病毒复制的关键环节，抑制HSVDNA复制而不抑制细胞DNA的合成。但在临床应用时，常出现耐药性。开发利用祖国中草药资源，寻找更新更好的抗HSV药物势在必行。马齿苋具有抗病毒作用。张小静［2］外用马齿苋治疗带状疱疹44例取得满意效果。从抗HSV-2 333株药效而言，与ACV比较，马齿苋合剂水提液不论是对HSV 所致细胞病变的抑制实验还是直接杀伤和阻断作用药效均要强。这可能与马齿苋合剂水提取液能提高模型小鼠淋巴细胞转化率，增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，促进脾脏淋巴细胞白细胞介素-2的分泌，增加免疫器官重量［3］有关。实验表明，药物浓度0.5 mg／ml时，对HSV-2所致的CPE有抑制作用，具有阻断和杀伤病毒作用，马齿苋合剂应用于临床疗效如何，有待我们在临床进一步观察和总结。
       【参考文献】
         　　［1］崔健 ,陈新 ,姜艳玲，等. 马齿苋的药用研究概况［J］．长春中医学院学报，2004，20(4):58．
       
       ［2］张小静. 马齿苋糊外敷治疗带状疱疹44例［J］.中华实用中西学杂志，2005，5(18)：497.
       
       ［3］吴娟，谢英. 马齿苋合剂水提取液对感染单纯疱疹病毒Ⅱ型小鼠免疫功能的影响［J］.河南中医学院学报，2007，3(22)：25．