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       【摘要】 
       目的建立霉茶缓释片的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，更有效地监控其质量。方法采用梯度洗脱法,对霉茶缓释片进行HPLC测定, 检测波长292 nm，流动相为乙腈-0.2%磷酸线性梯度洗脱对霉茶缓释片中总黄酮进行指纹图谱测定。采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本: 2004A)进行比较计算。结果通过软件的比较,霉茶缓释片的指纹图谱相似度均大于0.90，建立霉茶缓释片中总黄酮的共有指纹图谱。结论所建立的方法可作为霉茶缓释片的指纹图谱，有助于霉茶缓释片的质量控制。
       【关键词】  霉茶缓释片 霉茶 大叶蛇葡萄 高效液相色谱 指纹图谱
       霉茶为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡萄A.megalophylla Diels et. Gilg的枝叶加工而成，主要分布于湖北、陕西、四川等地。在湖北恩施地区，民间将其叶置沸水中稍烫，沥干，摊放通风处至表面上有白霉，泡茶服，称为霉茶［1］。霉茶缓释片主要是以霉茶总黄酮提取物为原料制成的缓释片。霉茶中主要有效部位为总黄酮，经药理实验表明，霉茶总黄酮提取物可明显降低糖尿病家兔的血糖，减轻其肾组织的损害，显著抑制NOS的活性，稳定血清NO的含量，表明霉茶总黄酮对T2DM有一定的治疗作用［2］。现代药理研究其同属植物广西藤茶总黄酮提取物,具有降血糖、抗炎、镇痛和增强免疫作用［3］。本研究建立了HPLC 对霉茶缓释片进行指纹图谱的测定方法,建立霉茶缓释片的总黄酮的共有指纹图谱，为霉茶缓释片质量控制提供科学依据。
       1  仪器与试药
       戴安P680高效液相色谱仪（四元泵、紫外检测器及配套色谱工作站）; SC-101型鼓风电热恒温干燥箱(上海市仪器试验总厂); Mettler-Toledo AG285型分析天平（Mettler-ToledoGmbH，Laboratory Weighing Technologies，Soitzerland）；DZHW型调温电热套（北京市永光明医疗仪器厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；蛇葡萄素，杨梅素，槲皮素对照品（为自制，从霉茶中提取分离得到，经UV、MS、1HNMR、IR光谱分析鉴定结构，并经HPLC法检测，含量在98%以上）;其余均为分析纯，蒸馏水为自制。霉茶均采自于湖北省恩施州来凤县，经我院鉴定教研室鉴定为Ampelopsis megalophylla Diels et. Gilg。自制10批霉茶缓释片。
       2 方法
       2.1 色谱条件
       Aichrom Bond-AQ C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）; 流动相为乙腈-0.2%磷酸水，按表1的条件进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长：292 nm；进样量5 μl。
       2.2 供试品溶液的制备取霉茶缓释片20片，研细，取约2.00 g粉末，精密称定后，置索氏提取器中，加甲醇80 ml，回流至提取液无AlCl3显色反应，提取液甲醇定容于100 ml，经0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。表1  流动相梯度（略）
       2.3 对照品溶液的制备
       分别取蛇葡萄素、槲皮素、杨梅素对照品适量，置10 ml量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，经0.45 μm滤膜过滤，即得对照品溶液。
       2.4 稳定性及精密度考察
       取第3批霉茶缓释片，按照供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，连续进样5次，测定以11号峰杨梅素为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果,峰号1～11相对保留时间的RSD(%)分别为0.892，0.544，0.211，0224，0.127，0.131，0.129，0.146，0.066，0.097，0；相对峰面的RSD(%)分别为1.895，2.134，2.212，1.973，0.584，2.573，1.992，0.822，1.736，2.325，0，在24h之内基本稳定。
       2.5 重复性实验
       取第8批霉茶缓释片5份，分别按照供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，分别进样测定。结果,峰号1～11相对保留时间的RSD(%)分别为1.345，1.085，0.433，0.374，0.135，0.191，0.218，0.163，0.184，0.212，0；相对峰面的RSD(%)分别为2.337，2.501，2.234，2.311，0.530，2.878，2.809，2.645，1.905，2.165，0。
       2.6 霉茶总黄酮提取物HPLC指纹图谱及其技术参数
       2.6.1 霉茶缓释片HPLC指纹图谱建立及分析见图1。
       2.6.2 共有指纹峰的标定采用中国药典委员会推荐的相似度评价软件系统进行分析［4］，根据相关要求［5］，确定共有峰和指纹峰。以相对保留时间标定其共有峰11个，以第11号峰为参照峰S，测定各共有峰相对保留时间，结果表明RSD﹤3.0%。见图2。
       2.6.3 共有指纹峰面积的比值根据10批霉茶总黄酮提取物色谱图测定结果，以S参照峰峰面积为1，计算各共有指纹峰相对峰面积。结果见表2。表2  不同样品的共有峰相对面积值（略）
       2.6.4 共有峰的归属在同样色谱条件，测定蛇葡萄素、槲皮素、杨梅素，对比其保留时间和相应时间位置的色谱峰的紫外光谱情况，确定指纹图谱中的3号峰为蛇葡萄素，9号峰为槲皮素，11号峰（S峰）为杨梅素。
       2.7 指纹图谱及相似度分析根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（试行）》的要求，采用中国药典委员会推荐的相似度评价软件系统进行分析［4］，得出霉茶缓释片的HPLC共有指纹图谱，见图3，并计算相似度。结果见表3。表3  霉茶各缓释片批次样品指纹图谱的相似度（略）
       3 讨论
       3.1  流动相的选择及梯度洗脱条件的确定采用乙腈-磷酸缓冲盐、乙腈-水、乙腈-0.1%-0.5%不同浓度的冰醋酸、乙腈-0.1-0.3%磷酸、甲醇-水、甲醇-不同浓度的磷酸水体系，实验结果表明乙腈-0.2%磷酸系统较好，基线漂移小、出峰数目多、峰分离情况也比较理想。在此基础上，调整了乙腈与0.2%磷酸梯度洗脱的比例关系，最终确定了色谱洗脱条件。
       3.2  检测波长的选择采用二极管阵列检测器(DAD)，考察了200～400 nm范围波长的图谱，分别测试样品在波长220，254，292，365 nm处的指纹图谱，其中292 nm检测条件下基线最平稳，检测到的峰最多，分离度好，最终确定检测波长为292 nm。
       
       所建立的霉茶缓释片HPLC 指纹图谱中,有11个共有特征(指纹) 峰,各特征峰的相对保留时间和相对峰面积可以作为霉茶缓释片质量伪劣的依据,同时借助国家食品药品监督管理局推荐的中药色谱指纹图谱的相似性计算软件建立的霉茶缓释片HPLC 共有指纹图谱,可作为霉茶缓释片的质量控制依据。所建立的方法有较好的重复性、精密度和稳定性,为霉茶缓释片的质量控制以及衡量其质量的优劣提供部分科学依据。
       【参考文献】
         　　［1］湖北省卫生局.湖北中草药志，第2册［M］.武汉:湖北人民出版社,1982：1078.
       
       ［2］黄先菊，朱慧玲，邓云帆，等.2型糖尿病家兔模型的建立及大叶蛇葡萄总黄酮降血糖作用研究［J］. 实用中医药杂志,2006,22(10):603.
       
       ［3］钟正贤，周桂芬，陈学芬，等.藤茶总黄酮药理作用研究［J］. 中国中医药科技,2004,11(4):224.
       
       ［4］洪筱坤,王智华.中药数字化色谱指纹图谱［M］. 上海：科学技术出版社,2003:68.
       
       ［5］谢培山.中药色谱指纹图谱质量控制模式的研究和应用［M］. 世界科学技术-中药现代化, 2001,3(3):18.