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       【摘要】 
       目的建立并优化青天葵样品总DNA提取方法及随机扩增多态性DNA（RAPD）反应。方法采用改进的高盐低pH法提取青天葵鲜叶和药材样品，通过正交设计和均匀设计，改变反应体系和扩增程序优化随机扩增多态性DNA。结果使用高盐低pH值法可较好地提取新鲜叶片的DNA，药材叶片含杂质较多，但都能用于RAPD。反应体系为：缓冲液2.0 μ1，0.5 μl dNTP（各2.5 mmol·L-1），0.8 μl Mg2+（25 mmol·L-1），0.5 μl引物（20 pmol·μl-1）, 0.2 μl Taq酶（5U·μ1-1），1 μl DNA（50 ng），1μl BSA（20 mg·ml-1），加双倍蒸馏水至20 μl。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40个循环；72℃延伸5 min。结论建立并优化了的青天葵样品总DNA提取方法及RAPD反应体系。
       【关键词】  青天葵 DNA提取 随机扩增多态性DNA 正交设计 均匀设计
       Extraction of Total DNA from Nervilia fordii and Optimization of RAPD Analysis
       DU Qin, WEI Zhiqiang,TIAN Jun
       College of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
       Abstract：ObjectiveTo establish and optimize the methods of total DNA extraction and RAPD analysis of Nervilia fordii. MethodsLow pH extraction medium with high salt method was adopted to extract genomic DNA from fresh and medicinal material leaves of Nervilia fordii, and the randomly amplified polymorphic DNAs(RAPD)technique was optimized through changing PCR reaction system. ResultsLow pH extraction medium with high salt was better to extract fresh leaves than medicinal material leaves, but both of them could be suitable to RAPD. The optimal RAPD conditions was as follows: 20μl solution contains 1×Buffer solution, 0.5μl dNTP(each2.5mM)，0.8μl Mg2+(25mM)，0.5μl Primer(20pmol·μl-1), 0.2μl Taq DNA polymerase(5U·μl-1)，1μl DNA(50ng)，1μl BSA(20mg·ml-1)．RAPD program was 3 min at 94℃ for predenaturation，then 40 cycles of 30 sec at 94℃ for denaturation,30 sec at 40℃ for annealing，1 min at 72℃ for extension，finally extension at 72℃ for 5 min．ConclusionThe extraction  methods for total DNA and RAPD analysis of Nervilia fordii have been established.
       Key words：Nervilia fordii;   DNA extract; RAPD;   Orthogonal design；  Uniform design
       随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorpHic DNA，RAPD)是由Williams和Welsh两个研究小组在不同实验室同时发展起来的一项DNA多态检测技术［1，2］。邵鹏柱等率先使用此分子标记技术鉴定人参［3］。由于不需要对DNA的序列进行测定，随机引物扩增已经广泛用于中药品种及品质的鉴定。
       
       青天葵为兰科芋兰属植物毛唇芋兰Nervilia fordii (Hance) Schltr.的叶或带球茎的叶，具有清热解毒、散结消疬等功效［4］。青天葵按商品规格分为大叶、中叶、小叶3个品种，同属植物毛叶芋兰Nervilia plicata (Andr.) Schltr.民间也作为青天葵使用。目前对于青天葵的鉴定大多只限于形态学，尚未见青天葵分子鉴定研究报道。本实验采用建立青天葵样品总DNA的提取方法并用正交设计和均匀设计优化及RAPD反应条件，为进一步的分子生物学实验奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  材料　
       青天葵干品药材购自广东致信药业公司，青天葵新鲜叶片采自广州中医药大学药园种植的青天葵植株，均经笔者鉴定为毛唇芋兰Nervilia fordii (Hance) Schltr.。PCR反应所用的试剂购自上海生工生物技术服务公司，其余试剂均为化学纯。
       1.2 仪器
       BIO-RAD PTC-200 PCR仪；SIGMA 3-18K离心机；GENE QUANT PRO紫外分析仪；VILBER Bioprint 1000凝胶成像系统；北京六一仪器厂电泳槽。
       2 方法
       2.1 DNA提取方法
       采用高盐低pH值法提取DNA［5，6］。称取1～2 g青天葵新鲜叶片或0.2～0.3 g青天葵干品药材叶片用石英砂研磨，加入5 ml 65 ℃缓冲液（100 mmol·L-1 NaAc，50 mmol·L-1 EDTA，500 mmol·L-1 NaCl，1.4% SDS）65 ℃水浴30 min，时时振摇，10 000 g离心10    min。取上清加入2/3倍体积2.5 mol·L-1pH 4.8的醋酸钾溶液，4 ℃放置20 min，10 000 g离心10 min。吸上清液移入另一支离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)抽提反复颠倒混匀，于4 ℃10 000 g离心10 min，如中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿-异戊醇(24：1)抽提1次。取上清液加入1倍体积异丙醇，混匀后放入-20 ℃冰箱20 min。10 000 g离心15 min。所得DNA沉淀用70％乙醇洗2次，空气中干燥。溶于200 μl无菌水中，4    ℃保存。
       2.2 优化反应条件在相同的扩增程序下，正交设计PCR反应体系L16（45），每个体系中加入PCR Buffer 2 μl，用水补足至20 μl。见表1。
       2.3 优化PCR扩增程序以相同的反应体系，均匀设计不同的PCR的循环程序U6(46)，均匀设计表见表2。扩增基本程序如下：预变性94 ℃，3 min；40个循环；延伸72 ℃，5 min。
       2.4 电泳条件DNA样品与PCR样品于含Goldview 的1%的琼脂糖上电泳，5 V/cm, 50 min。凝胶成像系统拍照保存。
       3  结果
       3.1  DNA提取的优化本实验采用高盐低pH值法提取样品的DNA，因为实验材料有干品药材，王培训等［6］认为高盐低pH值法较CATB、苯酚法适合于干品药材。高盐低pH法的优越性还在于，不采用酚、氯仿等有毒试剂，不需CTAB、酶等价格较高的试剂，技术环节容易掌握［7］。本实验用高盐低pH法能较好地提取新鲜叶片，但用于提取干药材时得到的DNA颜色较深，电泳结果显示干叶片的DNA模板有降解，或看不到条带。于是采用药材提取前用30%乙醇处理浸泡7 d［8］，或对药材用100 mmol·L-1的Tris-HCl(PH 8.0)浸泡［9］后自然干燥，在提取缓冲液中加入2.5%的PVP和1%～2%的β-巯基乙醇［5，10～12］，提取得到的DNA样品较原先的颜色淡，用紫外分析仪测OD值和琼脂糖电泳显示提取的纯度与浓度没有较大的改善，李晓波等［9］认为药材中多酚类物质已经被褐化，所以加入防止褐化的β-巯基乙醇并无意义。所以最后在提取缓冲液中另加入2%的PVP。表1  正交设计PCR反应体系（略）表2  均匀设计PCR循环程序（略）
       3.2 RAPD反应优化正交设计反应体系的电泳图见图1。从图1中可以看出第2和第14反应体系扩增的条带数数量较多且清晰，极差分析得出最佳的反应体系为0.5μl dNTP（各2.5 mM），1.2μl Mg2+（25 mM），1.5 μl引物（20 pmol·μl-1）, 0.4 μl Taq酶（5 U·μ1-1），0.5 μl DNA（50 ng）。均匀设计扩增程序的电泳图见图2，用扩增的条带数对实验结果进行线形回归分析，由于方差太大不能进行线形回归分析，所以采用直观分析。除第2和第7道，其它几道扩增的条带数相似。同时考虑无模板的阴性对照不能扩出带来，所以在反应体系中加入BSA。确定优化的RAPD的条件如下：反应体系为：缓冲液2.0μ1，0.5 μl dNTP（各2.5 mM），0.8 μl Mg2+（25 mM），0.5 μl引物（20 pmol·μl-1）, 0.2 μl Taq酶（5 U·μ1-1），1μl DNA（50 ng），1μl BSA（20 mg·ml-1）加双倍蒸馏水至20 μl。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94    ℃变性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。
       4  讨论
       4.1 DNA的提取
       DNA的提取是进行分子生物学实验的重要先决条件，往往需要较高的纯度，但以PCR扩增为基础的RAPD技术对DNA模板的要求并不是很高。王培训等［13］认为中药3～100 ng扩增的条带数一致。本实验采用改进的高盐低pH法提取青天葵干品药材DNA模板的OD260/OD280的值大约为1.4～1.8之间，用OD260值计算模板的浓度后稀释使每个反应体系中使用50 ng，可扩增出较清晰的条带，如果不稀释模板就不能扩出条带，可能的原因是模板浓度太高或是所含的杂质影响了Taq酶的活力。
       4.2  RAPD反应
        
       PCR反应的优化大多选用单因素设计，本实验使用正交设计和均匀设计对实验条件进行优化，结果显示基本达到优化的要求，并减少了实验次数，节省了时间。RAPD反应只使用一条10个碱基的引物，特异性较低，易出现非特异性条带。所以本实验把无模板的阴性对照作为一项重要的指标来确定PCR的反应条件。实验结果显示反应条件的配比比扩增程序对PCR的扩增影响较大。
       
       致谢：广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺副教授、杨锦芬博士后给予本研究大力帮助，特此致谢！
       【参考文献】
         　　［1］Williams J G K.DNA ploymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucl Acids Res., 1990, 18: 6531.
       
       ［2］Wesh J. Polymirohisnis generated by arbitrary primed PCR in the mouse：application to strain identification and genetic mapping［J］.Nucl Acids Res., 1991, 19: 303.
       
       ［3］Cheung KS，Kwan HS，But PP，et a1.Pharmacognositical identification of American and oriental ginseng roots by genomic fingerprinting using arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR) ［J］.Journal of EthnopHarmacology ，1994，42(1)：67.
       
       ［4］江苏新医学院.中药大辞典，上册［M］．上海：上海科技出版社，2005:891.
       
       ［5］邹喻萍，汪小全，雷一丁,等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定［J］.植物学报，1994,36(7)：522.
       
       ［6］王培训，黄丰，周联，等.植物中药材总DNA提取方法的比较［J］.中药新药与临床药理，1999，10(1)：l8.
       
       ［7］王传堂，黄粤，杨新道，等.改良CTAB法和高盐低pH值法提取花生DNA 的效果［J］.花生学报，2002，31(3)：20.
       
       ［8］邹佳宁，宋聚先，常楚瑞 ，等.不同预处理方法对天麻块茎总DNA提取效果的影响［J］.贵阳医学学报，2007，32(2)：123.
       
       ［9］李晓波，冯波，张朝晖，等. 植物药材总DNA提取［J］.中草药，2003，33(7):652.
       
       ［10］陈昆松，李方，徐昌杰，等．改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA 的大量提取［J］.遗传，2004，26(4)：529.
       
       ［11］郭宝林 ，刘万水，黄文华,等.影响总DNA提取因素的探讨［J］.中国中药杂志，2006,31(11):924.
       
       ［12］严萍，赵树进.中药何首乌总基因组DNA的提取［J］.时珍国医国药，2007,18(3):607.
       
       ［13］王培训，李劲平，黄丰，等.RAPD技术在干品中药材鉴别研究中的应用［J］.世界科学技术，2001，3(3)：46.