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       【摘要】 
       目的观察推拿加功能训练对膝骨关节炎家兔模型关节液中细胞因子IL-1β和TNF-a的影响，探讨推拿加功能训练治疗膝骨关节炎的机制。方法将新西兰大白兔40只随机分为空白对照组(A组)、模型对照组(B组)、电针治疗组（C组）、手法治疗组(D组)。除A组外，其余3组将大白兔左膝关节伸直位石膏固定7周制成骨性关节炎动物模型，造模成功后,A组和B组正常饲养,不处理；C组电针治疗，D组给予推拿手法加功能训练治疗，连续治疗21 d。处理前、后分别取各组家兔关节冲洗液，采用放射免疫分析法（RIA），测定关节冲洗液中IL-1β和TNF-a的含量。结果经治疗后，C、D组与A、B组比较有显著性差异(P<0.05)；D组治疗前后有显著性差异(P<0.05)。结论推拿加功能训练治疗能降低膝骨关节炎关节液中细胞因子IL-1β和TNF-a的含量,从而发挥对膝骨关节炎的防治作用。
       【关键词】  膝骨关节炎 推拿手法 细胞因子
       膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA) 是临床中常见的关节疾病，好发于中老年人，是由于关节滑膜退变，软骨破坏引起的以膝关节疼痛、僵硬和活动受限为特征的慢性骨关节病，主要病变为膝关节软骨退行性变和继发性骨质增生。近年来,临床上不断报道用针灸、推拿加功能训练及针刀等方法治疗膝骨关节炎取得较好疗效［1］。研究发现，细胞因子IL-1β及TNF-a是参与骨性关节炎进程的重要介质, 是炎症反应的重要调节剂，是调节炎症的始动因素，与软骨破坏密切相关［2］。本实验研究推拿加功能训练对膝骨关节炎家兔模型细胞因子的影响,旨在证实推拿手法治疗膝骨关节炎的疗效，探讨膝骨关节炎的发病机理。
       1  材料与仪器
       1.1  仪器与试剂IL-1β和TNF-α放射免疫测定药盒从解放军总医院放免研究所购买，采用放射免疫分析法（RIA），放免测定程序按试剂说明书进行。离心机(中佳公司,KDC-2046型)、电针仪(广东省汕头市医用设备厂, 6805-β)和放射免疫γ计数器(众城公司, DFM-96型10管)等。
       1.2 动物健康新西兰大白兔40只(从重庆医科大学动物中心购买)，雌雄各半，雌无孕，体重2.0～2.5kg。随机分为空白对照组（A）、模型对照组（B）、电针治疗组（C）和手法治疗组（D），每组10只。造模成功后C，D两组每只分别给予电针或手法治疗，1次/d。
       2 方法
       　
       2.1  动物模型实验动物同等条件下稳定饲养7 d后，B，C，D组按照膝关节石膏制动法造模。先剪去所有动物左后肢踝关节以上的兔毛，用管型石膏将其左后肢伸直位固定，石膏外以透明胶纸封好，以防兔撕咬，若石膏松动或脱落者及时重新固定。制动满7周后，随机从A，B，C，D组各抽出1只动物处死，取关节软骨作病理检查以观察造模情况，确定模型成功后解除石膏外固定。
       2.2 组织学检查分别于造模成功后和治疗结束后随机从B，C，D各组中抽出1只家兔处死，处死后立即切取家兔胫骨平台内侧关节面的完整软骨及软骨下骨组织标本，用10％的甲醛溶液固定48 h，脱钙2～3 d，石蜡纵向包埋固定，常规切片，HE染色。观察滑膜与软骨的病理变化［3］。
       2.3 推拿加功能训练方法D组每天用按摩、揉捏、点压、分筋、理筋等手法以松解股四头肌，顺逆时针旋揉髌骨，再作内旋内收、外展外旋、屈伸髋和膝关节各5次，15 min/次，最后平地赶跑100 m，治疗1次/d，连续治疗21 d；C组参照《实验针灸学》［4］与《动物针灸学》［5］,取左后肢“内外膝眼、阳陵泉、血海、足三里和梁丘”6个穴位。以30号、1寸毫针针刺，得气后，针柄接电针治疗仪，电压6 V，疏密波型，频率1.6～2 Hz，输出调节强度1～2,以局部皮肤肌肉轻微颤动为度，1次/d，留针30 min/d，连续治疗21 d。 正常组、模型组正常饲养。
       2.4 关节液标本采集分别于造模成功后及治疗结束后采集A，B，C，D四组的关节液，获得4组动物膝关节冲洗液，回收量0.4～0.6 ml，平均0.5 ml，于-20℃低温冰箱中保存待测。具体方法：施行膝关节穿刺，证实刺入关节腔后，注入0.9%的生理盐水0.5 ml，反复回抽、注入3次后，再尽量抽出腔内液体。抽取关节液后，每只兔肌注2万单位庆大霉素，以防膝关节感染。采用放射免疫分析法（RIA）处理标本，放免测定程序按试剂说明书进行［6］。
       2.5 统计学处理方法所有实验数据用SAS9.0以上软件进行分析,以±s表示,组间差异采用方差分析(ANOVA)中的SNK法,各组治疗前后差异采用t检验，以P<0.05作为显著性差异的标准。
       3 结果
       3.1  病理切片观察造模后随机从各组中取出1只动物处死,解剖A组动物,肉眼观察膝关节面光滑呈淡蓝色；B，C，D组动物关节软骨面粗糙呈黄色，边缘骨质破坏，有骨赘增生。病理切片采用HE染色，观察发现A组动物关节滑膜无增厚，软骨细胞排列均匀，无增生，软骨边缘光滑；B，C，D组关节滑膜增厚，有炎性细胞浸润，软骨细胞排列不均，边缘破坏，粗糙不平，有软骨细胞增生。见图1～2。
       3.2  IL-1β的测定如表1所示，A组各时间段均未检出IL-1β，B，C，D 3组IL-1β均呈高表达，但B组与A组比较有非常显著差异(P<0.05)。IL-1β的高表达，说明其是参与骨性关节炎发病进程的重要介质。C，D组与B组比较IL-1β水平均降低，有非常显著的统计学差异(P<0.05)，D组治疗前后有显著性差异(P<0.05)，说明手法与电针治疗能有效抑制骨性关节炎发病过程中的炎性细胞因子。表1  治疗前后各组关节液中IL-1β的含量（略）
       3.3  TNF-α的测定见表2。A组各时间段均未检出TNF-α；B，C，D 3组TNF均呈高表达，B组与A组比较有非常显著性差异(P<0.05)。TNF-α的高表达，说明其在兔膝骨性关节炎发病过程中起着重要作用。C，D组与B组比较TNF-α水平均降低，有统计学差异(P<0.05)，电针组治疗前后有显著性差异(P<0.05)，说明电针能有效抑制骨性关节炎病理过程中的炎性细胞因子。表2  治疗前后各组关节液中TNF-α的含量（略）
       4  讨论
       4.1  传统医学对KOA的认识骨关节炎属于传统医学骨痹范畴。《灵枢·九针》曰：“五劳所伤，久立伤骨，久行伤筋，久坐伤肉”的记载。《素问·脉要精微论》曰:“膝者筋之府，屈伸不能，行则偻附，筋将惫矣。骨者髓之府，不能久立，行则振掉，骨将惫矣。”《灵枢》云:“经脉者，所以行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节者也。”“血和则经脉流行，营复阴阳，筋骨劲强，关节清利矣。”笔者认为不论外伤还是劳损，最终都导致局部血淤气滞而发病。膝骨性关节炎的主要病机是“虚与阻”,虚主要是肝肾虚、血虚；阻主要是血淤气滞，寒凝等，治疗宜补肝肾、活血化淤，行气通经为主。
       4.2  IL-1β及TNF-α与骨性关节炎发病机理的探讨现代医学认为，骨关节炎是一种非特异性疾病，临床上以关节疼痛、肿胀、活动受限为主要表现，其特征是功能退变，软骨损害，骨关节面周围的新骨形成。近年来发现，已知的细胞因子IL-1β和TNF-α是参与骨性关节炎发病进程中的重要介质，是炎症反应的重要调节剂，是调节炎症的始动因素。IL-1β对关节软骨细胞代谢的干扰作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅸ型胶原蛋白的合成，促进I、Ⅲ型胶原蛋白的合成，而使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和合成蛋白多糖，IL-1β还通过促进软骨细胞合成与分泌金属蛋白酶提高软骨基质中溶剂蛋白分子酶类的活性而降解关节软骨。实验研究发现骨性关节炎破坏可用IL-1β、IL-6、TNF的选择性抗体，细胞因子受体拮抗蛋白，可溶性或转移性细胞因子受体的分子所修复，说明细胞因子与软骨破坏密切相关［7］。本实验造模组中IL-1β和TNF-α保持高含量，说明IL-1β、及TNF-α是骨性关节炎中起主要调控作用的一种炎性介质，对骨性关节炎的发生具有促动作用。同时对骨性关节炎引起的继发病理过程也有影响，IL-1β本身可能是一种强有力的致痛物质。
       4.3  推拿治疗膝骨关节炎的机理探讨中医认为膝骨关节炎属于“痹证”范畴，为本虚标实之证。中医推拿着眼于骨运动与软组织松解，以骨运动为主，侧重于松解膝关节周围软组织的粘连。推拿患部可使毛细血管扩张开放，改善局部血液循环促进淋巴循环和水肿增加肌肉神经的营养供给，加强软骨组织吸收泵的作用缓解肌肉痉挛，消炎镇痛，从而进一步改善膝关节功能和关节积液的逐渐吸收。推拿手法功能训练可以驱邪止痛、益气行血、疏经通络，通过对髌骨抱揉和膝关节被动屈伸可以起到松解粘连、扩大关节间隙和滑利关节的作用［8］。实验研究发现，推拿加功能训练组治疗前后有明显差异，推拿手法治疗能降低膝骨关节炎关节液中细胞因子IL-1β和TNF-α的含量，从而抑制了细胞因子对膝关节局部的损害，说明推拿手法治疗具有防卫免疫、抗病镇痛的作用,临床上通过合理地运用推拿手法治疗膝骨关节炎，能缓解症状，防止病情恶化。本实验为该推拿加功能训练应用于OA的防治提供了可靠的实验依据。
       【参考文献】
         　　［1］俞杰,明顺培.针灸治疗膝骨关节炎近况［J］.针灸临床杂志,2001,17(3):55.
       
       ［2］周江涛,刘献祥. 骨性关节炎软骨破坏机制及治疗研究进展［J］.中医正骨,2004,16(11):56.
       
       ［3］江中潮，何洪阳，刘罡，等.骨生注射液对实验性骨性关节炎家兔血浆SOD和MDA的影响［J］.中国骨伤,2004，l7（10）:593.
       
       ［4］李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药药出版社,2003:314.
       
       ［5］胡元亮.实用动物针灸手册［M］.北京:中国农业出版社,2003:288.
       
       ［6］龚权 ，程传国.药物针刀疗法对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响［J］.中华实用中西医杂志,2004，17(24):3722.
       
       ［7］余丹丹.骨性关节炎实验研究进展［J］.中医正骨,2000,12(12)：50.
       
       ［8］周凤华,张志强.中药、推拿及针灸并用治疗膝关节骨性关节炎［J］. 中国临床康复,2006,10(23):149.