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       【摘要】 
       目的观察穴位埋线和胰岛素联合应用对拟阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）大鼠学习记忆的影响，并探讨其可能的治疗机制。方法大鼠海马CA1区微量注射冈田酸（Okadaic acid，OA）建立拟AD模型大鼠。肾腧、大椎穴位埋线、胰岛素侧脑室注射。用Morris水迷宫实验检测其学习记忆能力，电镜观察海马CA1区神经元超微结构变化，免疫组化方法观察胆碱乙酰转移酶（ChAT）的表达 。结果与模型组比较，穴位埋线组、联合组的学习记忆能力明显改善（P <0.01），海马CA1区神经元凋亡现象明显改善，ChAT表达增加（P<0.05），联合组更为显著（P<0.05）。结论穴位埋线和胰岛素联合应用对拟AD大鼠学习记忆的改善作用强于单用穴位埋线，可能和改善海马CA1区神经元超微结构及胆碱能系统功能有关。
       【关键词】  阿尔茨海默病 穴位埋线 胰岛素 学习记忆 凋亡 胆碱乙酰转移酶
       Effect of Catgut Implantation at Acupoint and Insulin on Learning and Memory Ability of Alzheimer’s Disease in Rats
       YANG Yu， MIAO Ting， PAN Ya， XU Guoqiang, JIANG Naichang
       Deparment of Physiology, Guiyang Medical College, Guiyang  550004,China
       Abstract：ObjectiveTo study the effects and its possible mechanism of Catgut implantation at acupoint and Insulin on the learning and memory abilities of Alzheimer’s Disease (AD) rats.MethodsOkadaic acid(OA) was injected into hippocampal CA1 region of rats with microdosis repeatedly to establish Alzheimer’s disease-like model ，and then insulin  was injected into the lateral ventricle of cerebrum and catgut was implanted in Shenshu and Dazhui acupucture point .The learning and memory capacity of rats were assessed through Morris Water Maze behavioral test. Ultrastructure was observed by electron miscroscope and the expressions of ChAT apoptosis of neurons were examined by immunohistochemistry in hippocampus CA1 region of the rats.ResultsCompared with model group, learning and memory capacity was improved obviously, and the expression of ChAT in hippocampal CA1 region was increased significantly in rats of catgut implantation at acupoint group and combination group, moreover, the effects were better in combination group .ConclusionCombination of  Catgut implantation at acupoint and Insulin is more effective than only Catgut implantation at acupoint in Alzheimer’s disease rats，the mechanism might be related with improving ultrastructure in hippocampal CA1 region and function of central cholinergic system.
       Key words：Alzheimer’s disease;  Catgut implantation at acupoint;  Insulin;  Learning and memory;  Apoptosis;  Choline acetyl-transferase
       阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD) 主要表现为记忆障碍、认知功能减退等胆碱能神经受损所致的神经功能紊乱。其病理特点为老年斑（senile plaques，SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）及神经元丢失。胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性下降被认为是AD的一个标志性生化特征［1］。目前AD的防治尚无重要突破。针灸通过激发机体潜能、调节全身脏腑功能干预AD的病理过程 ［2，3］，而胰岛素在促进神经生长发育、调节神经元生长及递质的释放等方面起着重要作用［4］。本课题组前期报道胰岛素具有改善拟AD大鼠学习记忆的功效。本研究采用穴位埋线联合胰岛素处理拟AD大鼠，通过观察海马神经元超微结构，ChAT阳性表达以探讨埋线联合胰岛素对拟AD大鼠学习记忆的影响和可能机制，为中西医结合治疗AD提供实验依据。
       1  器材与方法
       1.1  动物分组
       SD大鼠80只，3～5月龄，体重(280±20) g，雄性、健康，由贵阳医学院动物中心 ［合格证号：SCXK（黔）2002-0001］提供。所有大鼠随机分为4组：①对照组；②拟AD模型组（模型组）；③肾腧（双）、大椎穴位埋线组（埋线组）；④穴位埋线+胰岛素组（联合组）。每组20只。自然条件下饲养，自由饮食。
       1.2  试剂和仪器Okadaic acid（OA）（美国Sigma公司），临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO）中，配制成浓度为0.4mmol/L的溶液;抗ChAT多克隆抗体（基因公司）。研究用生物显微镜（德国Leica）； 日立－600型透射电镜（日本日立）；Morris水迷宫。
       
       1.3  制作拟AD模型模型组、埋线组、联合组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/100 g）后，固定于大鼠脑立体定位仪上。参照大鼠脑立体定位图谱，将自行设计的十字形套管插入海马CA1区（前囟后3.6 mm，中线右旁开2.4 mm，深度2.7 mm），通过套管将OA溶液0.5 μl注入海马CA1区。5 min注射完毕，留针10 min。隔天注射1次，共5次；对照组用同样方法注入等体积的对照液10% DMSO。术后创面滴加庆大霉素，肌注青霉素5 d预防感染。
       1.4  胰岛素侧脑室注射联合组大鼠于拟AD模型制作之时在左侧颅骨钻孔（前囟后1.3 mm，中线左侧1.6 mm，深3.6 mm），注射生物合成人胰岛素0.2 IU（40 IU/ml），5 min注射完毕，留针10 min。隔天1次，共注射5次。对照组、模型组大鼠用同样的方法注射等体积的人工脑脊液。
       1.5  肾腧、大椎穴位埋线埋线组大鼠于拟AD模型制作同时,常规消毒后在双侧肾腧穴和大椎穴，用8号针头埋入4/0号5 mm羊肠线，每7天1次。
       1.6  大鼠行为学检测实验于海马CA1区首次注射后的第4周开始进行。第1～6天进行定向航行试验，记录60 s内大鼠从入水中到爬上站台所需时间即逃避潜伏期。第7天进行空间探索实验，记录120 s内大鼠在第Ⅲ象限的游泳时间和穿越站台次数。
       1.7  灌注取材水迷宫试验结束后，各组取5只大鼠的海马CA1区组织。2.5%戊二醛和1%锇酸固定， Epon812环氧树脂包埋，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察海马CA1区神经元的超微结构。各组剩余大鼠经10 %水合氯醛麻醉后，生理盐水和10%中性甲醛（4℃）灌注，断头取脑，置10%中性甲醛中浸泡固定。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状位切片，片厚4 μm。
       1.8  免疫组织化学两步法切片脱蜡至水化， 3%H2O2孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶。切片浸入0.01 mol·L-1TBS溶液（pH6.0）中，微波热修复。滴加兔抗ChAT多克隆抗体， 37℃水浴箱孵育45 min。滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，37℃恒温水浴箱孵育20 min ；使用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗，复染，脱水，封片。
       1.9  显微镜观察采用Leica摄像显微镜观察并照像。计数每张切片4个随机高倍视野中阳性细胞数后取平均值作为计数结果，每组15张切片计数结果取平均值作为最后结果。
       1.10  统计学处理应用SPSS11.5统计分析软件包，数据先进行单因素方差分析，多组之间差异两两比较采用SNK检验进行分析，P<0.05有统计学意义。统计结果以±s表示。
       2  结果
       2.1 大鼠行为学检测各组大鼠在Morris水迷宫中定向航行实验结果见表1。从第1天开始，模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期均明显延长（P<0.01）；埋线组、联合组与模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）；且从第5天开始联合组与埋线组比较，平均逃避潜伏期出现显著差异（P<0.01）。各组大鼠空间探索实验结果见表2。模型组与对照组比较，第Ⅲ象限活动时间明显缩短（P<0.01），穿越站台次数明显减少（P<0.01）；埋线组、联合组与模型组比较，第Ⅲ象限活动时间明显延长（P<0.01），穿越站台次数明显增多（P<0.01）；且联合组与埋线组比较，第Ⅲ象限活动时间明显延长（P<0.05），穿越站台次数亦明显增多（P<0.05）。表1  各实验组大鼠定向航行实验平均逃避潜伏期（略）表2  各实验组大鼠第Ⅲ象限活动时间和穿越站台次数（略）
       2.2 透射电镜观察海马CA1区神经细胞对照组细胞核形态规则，染色质颗粒细小，均匀分布，细胞器丰富；模型组细胞核形态异常，核膜相对完整,呈皱缩状态，染色质浓缩，分布不均，凝集成块，边集在核膜内侧,细胞器破坏，整个细胞密度明显增加，部分细胞核呈固缩状态；埋线组细胞核形态欠规则，染色质轻度凝集和边集；联合组染色质细小分散，细胞器较丰富，细胞形态接近对照组。
       2.3 海马CA1区ChAT的表达正常大鼠海马CA1区锥体层有较多ChAT免疫阳性神经元分布,棕黄色的颗粒主要位于神经元胞质内；模型组与对照组相比，ChAT免疫反应阳性神经元明显减少(P<0.01）；埋线组、联合组同模型组比较，ChAT免疫反应阳性神经元明显增多(P<0.05)，且联合组同埋线组比较，增多更明显(P<0.05)。见表3。表3  各实验组大鼠海马CA1区、顶叶皮层ChAT免疫反应阳性神经元计数（略）
       3 讨论
       中医认为AD的发生与肾、脑有密切关系。脑髓的充养,依靠肾的藏精,肾中精气亏虚,脑髓得不到适当的补充,则出现精神意识活动障碍。治疗应以补肾益精为主，开窍醒神为辅［5～7］。足太阳膀胱经下行联络于肾，上行进入颅内联系于脑。“肾腧”穴属膀胱经，刺激该穴可起到补肾益髓的作用。督脉上额交巅上，入络脑。大椎为督脉要穴，又为诸阳之会，刺激本穴能振奋阳气，调节全身脏腑功能，从而起到健脑益髓的作用。穴位埋线是一种融多种疗法、多种效应于一体的复合性治疗方法。羊肠线作为异体蛋白埋入穴位后，以线代针，对机体产生长久的刺激，延长针刺效应时间，增加腧穴功能。
       中枢神经系统内广泛存在胰岛素和胰岛素受体(IR), 胰岛素在神经系统中有着特殊的生物学效应。它可以调节神经元对葡萄糖利用，为神经元活动提供能量；同时胰岛素还可促进Ach合成，调节ChAT表达；另外，胰岛素还可抑制糖原合成激酶-3β（GSK-3β）的活性，减少Aβ产生。研究表明,胰岛素及其受体通过激活特殊信号途径参与调控学习和记忆,一方面可通过Grb-r/SOS，Ras/Raf，MEK/MAP激酶等细胞分子机制影响学习记忆的电生理基础长时程记忆的形成;另一方面可通过IRS-1、PI3-激酶、蛋白激酶C参与记忆过程［8］。
       神经元丢失是AD的主要病理特征,细胞凋亡在AD神经元丢失中起重要作用。细胞凋亡(apoptosis)是细胞基因控制的一种主动死亡过程。在培养细胞、动物模型以及AD病人的尸解中，均发现细胞凋亡的证据［9，10］。本研究的形态学结果显示模型组大鼠海马神经细胞出现染色质凝集、边集、核固缩等，都是细胞凋亡的典型表现，说明细胞凋亡参与了AD中枢神经系统损害的病理过程，进而引起神经细胞丢失，影响了模型组大鼠学习记忆能力。
       中枢胆碱能神经系统与学习记忆关系密切。该系统通过释放乙酰胆碱(Ach)实现并维持学习记忆等功能。ChAT是催化Ach生物合成的限速酶,是反映大脑胆碱能系统功能的标志酶。研究发现，AD患者的认知障碍与中枢胆碱能系统退变密切相关。AD早期即出现基底前脑的胆碱能细胞严重变性，ChAT及Ach含量减少 ，随着病程的进展，ChAT活性明显下降，并且与痴呆的严重程度相关［11］。在本研究中，模型组海马ChAT阳性神经元数量明显减少，由此造成的Ach合成不足可能构成了拟AD大鼠学习记忆能力减退的神经分子生物化学基础。
       
       穴位埋线和胰岛素联合应用与单用穴位埋线比较，大鼠学习记忆能力明显提高，海马神经元超微结构改善， ChAT表达增多。表明穴位埋线和胰岛素联合应用比单用穴位埋线对拟AD大鼠的作用更明显。推测其机理可能为埋线即时效应明显，只能在短时间内调节体内递质、激素、受体之间的活性作用,而胰岛素作用持久，补充了由于多种原因导致的细胞受损而减少的活性物质, 埋线和胰岛素作用侧重各有不同,两者结合，发挥了各自优势，弥补了相互不足,使埋线的效应作用被加强或延长，从而改善了拟AD大鼠学习记忆的能力。
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