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       【摘要】 
       目的利用激光共聚焦显微镜研究蚤休皂苷（Pa）对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞（ECV304细胞）损伤的钙离子（Ca2+）的变化及其机制。方法体外培养ECV304细胞，建立氧化损伤的细胞模型，然后分为5个实验处理组：①正常对照组；②氧化损伤组；③高浓度蚤休皂苷（1 μg/ml）组 ；④中浓度蚤休皂苷（100 pg/ml）组；⑤低浓度蚤休皂苷（10 pg/ml）组；应用激光共聚焦显微镜观察其细胞凋亡的形态学差异。并利用激光共聚焦显微镜观察、图像分析仪分析各实验分组细胞中游离Ca2+的表达、激光共聚焦显微镜描记预处理前后Ca2+的动态表达。结果损伤组细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常组(P<0.01)，而各蚤休皂苷预处理组均使Ca2+荧光强度下降，显著低于损伤组(P<0.01)，并呈剂量依赖性效应。H2O2损伤剂量的刺激下，ECV304胞浆内的游离Ca2+呈现双相变化：由静息状态持续增加到峰值，ΔF为37.22±3.72，平台期与静息状态荧光值的变化ΔP为7.65±0.69，加入蚤休皂苷预处理10 min后，再加入100 μmol/L的H2O2 ，ΔF和ΔP均明显下降(P<0.01)。结论蚤休皂苷可以保护H2O2造成的ECV304细胞的氧化损伤，与抑制了钙离子介导的凋亡通路有关，达到保护内皮细胞、抗动脉粥样硬化的目的。
       【关键词】  蚤休皂苷 内皮细胞 凋亡 钙离子 动脉粥样硬化
       Effects of Pariphyllin on Calcium Ion Density in Injured ECV304 Induced by Hydrogen Peroxide
       GAO Linlin, LI  Furong, KANG Li, SI Yanhong,WANG  Hao
       1.Dept of Pathophysiology, Taishan Medical College, Taian,Shandong  271000,China; 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250014, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of Pariphyllin （Pa）on calcium ion density in injury ecv304 induced by hydrogen peroxide.MethodsECV304 cells were cultured in vitro, the oxidative injury was built by hydrogen peroxide (H2O2）,cells were divided into five experimental groups:1.normal,2.oxidative damage group,3.high density Pariphyllin（1 μg/ml）,4.medium density Pariphyllin （100 pg/ml）and 5.low density Pariphyllin（10pg/ml）.Laser confocal microscopy(LCM) was used to observe quiet state and dynamic change of the density of calcium ion (Ca2+).Results The LCM showed that in damaged group, the external Ca2+ concentation was the highest,but in pretreated groups,it was decreased in dose dependent manner（P<0.01）.H2O2 elicited an transient peak of ［Ca2+］i and then fell to a subsequent sustained higher plateau.Pretreatment with pariphyllin（1 μg/ml）for 10 minute significantly prevented the transient  increase and sustained the increase of ［Ca2+］i.ConclusionPariphyllin has protective action against oxidative damage of ECV304 induced by H2O2, its mechanism may be related to decreasing the cell apoptosis and inhibiting calcium ion-decreased mediated signal transduction .
       Key words： Pariphyllin;   HUVEC;   Apoptosis;    Ca2+;  Atherosclerosis
       
       内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发生的关键环节，目前占主导地位的“损伤-反应假说”和近来许多研究 ［1］证实内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用。H2O2可促进内皮细胞凋亡，而细胞凋亡在AS发生发展中起着重要作用［2］。
       有报道发现含蚤休的方剂能够减轻高脂血症大鼠动脉内皮细胞损伤，减少内皮细胞合成和释放内皮素［3］。具有保护动脉内皮细胞和抑制主动脉中膜平滑肌增殖的功效，从而具有防治动脉粥样硬化和高血压病的作用。但对于蚤休皂苷保护动脉内皮细胞损伤防治动脉粥样硬化发生的作用在国内外尚未见报道。为了进一步探讨中药蚤休对内皮细胞损伤的抑制机制，本实验应用激光共聚焦显微镜观察其凋亡的形态学差异。并利用激光共聚焦显微镜观察分析各实验分组细胞中游离Ca2+的表达；预处理前后细胞内Ca2+的动态表达，旨在进一步探讨蚤休皂苷对细胞损伤保护作用的机制及其之间的相互关系。
       1  材料与仪器
       1.1  材料
       人脐静脉内皮细胞株ECV304购于武汉大学典型培养物保藏中心；蚤休干片（购于济南建联药店），蚤休皂苷（Pariphyllin，Pa）为暗红色粉状结晶，由泰山医学院药物化学教研室提取鉴定，每0.5 kg蚤休干片得到皂苷结晶27 g，纯度为98.79%。用RPMI1640（Gibico公司，美国）培养液稀释至1 000，100，10 pg/ml，微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用； 荧光探针Fluo-3/ AM (Molecular Probes Inc产品，美国)溶于DMSO中，配成贮存液，放于-20℃冰箱保存；HEPES缓冲液(mmol/L )等试剂购于济南联星生物试剂公司。
       1.2 仪器
       激光共聚焦显微镜：美国Bio-Rad  Radiance  2100。
       2 方法
       2.1 细胞培养及干预将ECV304细胞在37℃，5%CO2条件下培养，以含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/ml，按每瓶2 ml接种于25 ml的细胞培养瓶，每48 h更换培养液1次。待细胞融合率为70%～80%时，无血清培养12 h后使细胞同步化于G0期，然后按分组分别加药进行预处理24 h，再加入氧化损伤药物H2O2，终浓度为100 μmol/L，作用12 h。细胞分组如下：正常对照组:不加任何药物的培养基；氧化损伤组: H2O2终浓度为100 μmol/L；蚤休皂苷高、中、低剂量预处理组: （1 μg/ml，100 pg/ml，10 pg/ml），调整各组细胞浓度为5×10～5×106个/ ml。
       2.2 激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+荧光强度的含量 将ECV304制成105个/ml的细胞悬液接种于35 mm Petri细胞培养皿中，实验分组加药同上， 孵育24 h后用HEPES缓冲液洗涤两遍，加入终浓度为10 μmol/L的Fluo-3/AM 37℃负载。40 min后再用HEPES缓冲液洗涤2次，立即置于激光扫描共聚焦显微镜下观察，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。实验中选用512线光束扫描成像，图像分辨率为512×512像素，采集频率0.2～0.5 Hz。使用Simple PCI软件收集Ca2+图像、分析Ca2+的改变。每个处理组选取大约30个细胞，记录平均荧光强度，以此来衡量ECV304内游离Ca2+的水平。
       2.3 激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+的动态变化 按以上所述负载ECV304，设定激光共聚焦显微镜激发波长为488 nm，扫描方式为时间扫描，时间间隔为每5 s一个循环，连续扫描600个循环。首先观测静息状态下细胞内Ca2+水平，然后预先加入终浓度为1 μg/ml的蚤休皂苷，10 min 后加入H2O2 ，终浓度为100 μmol/L；动态观测细胞内Ca2+水平的变化，使用Simple PCI软件收集Ca2+图像、Microsoft Excel 2000分析并绘制成荧光强度随时间变化的时间-效应曲线。实验所测定染色条件和激光扫描参数在整个实验过程中不变，每实验组先后测定3次。
       2.4 统计学处理
       实验数据以±s表示。采用SPSS 12.0软件包分析对实验数据进行one-way ANOVA分析及LSD两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+荧光强度的含量  各处理组细胞内游离Ca2+荧光强度的含量培养的ECV304负载Fluo-3/AM后，Fluo-3和游离Ca2+结合，在488nm波长的光激发下，可观察到荧光，其在胞浆内的分布较均匀，结果显示，H2O2损伤引起ECV304细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常组(P<0.01)，而各蚤休皂苷预处理组均使Ca2+荧光强度下降，显著低于损伤组(P<0.01)。且此效应呈浓度依赖性(P<0.01)。结果见表1。表1  Pa对细胞内游离Ca2+平均荧光强度的影响(略)
       3.2 激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内Ca2+荧光强度的动态变化  H2O2损伤剂量的刺激下，ECV304胞浆内的游离Ca2+呈现双相变化：由静息状态持续增加到峰值，ECV304细胞内游离Ca2+荧光强度值从静息状态时的15.56±1.57，迅速升高到峰值58.77±6.24，峰值荧光变化ΔF为37.22±3.72，之后下降至22.17±2.09，并维持于平台期，平台期与静息状态荧光值的变化ΔP为7.65±0.69，加入蚤休皂苷预处理10 min后，再加入100μmol/L的H2O2 ，ΔF和ΔP的变化见图1；与H2O2组差异显著(P<0.01)，见表2。表2  Pa对细胞内动态Ca2+平均荧光强度的影响(略)
       4 讨论
          
       蚤休,又称七叶一枝花。其基源为百合科重楼属的多种植物。药用历史悠久,其以蚤休之名首载于《神农本草经》，《唐本草》收录别名为重楼，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效。蚤休的药理活性多样，近年来国内外学者着眼于其生理活性和独特的药用价值，运用现代药理方法，为中药蚤休的一些临床应用提供了理论依据，同时也发现了它的一些新作用［4］。
       
       为研究蚤休皂苷对过氧化损伤后所导致的细胞凋亡的作用机制，在实验中我们采用荧光染料Fluo-3/AM结合激光扫描共聚焦显微镜技术测定细胞内Ca2+，其原理是Fluo-3与游离Ca2+有特异性亲和力，对游离Ca2+浓度变化非常敏感。其本身不能透过细胞膜，但与酯性基团AM连接后可导入细胞。Fluo-3/AM导入细胞后，在胞内非特异性酯酶水解作用下释放出Fluo-3， Fluo-3通常不被细胞器分隔，其与胞浆游离Ca2+结合后可被一定波长的光激发产生荧光，荧光强度与游离Ca2+浓度成正比。Ca2+浓度越多，荧光强度越大，因此是目前最理想的检测细胞内游离Ca2+的方法之一。
       
       激光共聚焦显微镜显示，蚤休皂苷干预后，深红色的胞核显著减少，晚期凋亡量减少；各蚤休皂苷预处理组均使Ca2+荧光强度下降，显著低于损伤组，因此，诱导内皮细胞的凋亡，同时长时间的钙超载又会引起细胞的死亡，这些作用可能是H2O2导致内皮细胞存活率下降的原因之一。H2O2升高可以引起内皮细胞存活率下降，诱导内皮细胞凋亡，而升高诱导的内皮细胞损伤和凋亡与H2O2升高细胞内游离钙以及激活有关。   
       
       外源性H2O2孵育引起ECV304内游离Ca2+浓度明显高于正常组，进一步作动态观察发现ECV304给予H2O2后所致胞内Ca2+升高呈双相变化：先快速增加到峰值，尔后下降维持于平台期，平台期Ca2+值介于峰值和静息值之间。
       
       细胞内Ca2+是一种重要的第2信使，机体细胞的许多生理活动均依赖于钙的参与［5］。正常生理机制对细胞内游离钙离子浓度的调控是有一定限度的,超过极限将导致细胞内游离钙离子浓度升高,引起细胞和线粒体钙超载,从而触发一系列有害的病理生理过程, 细胞内游离钙作为重要的信使参与多种细胞功能的调节,介导细胞对刺激的反应［6］。本实验观测到H2O2可引起内皮细胞［Ca2+］显著升高,并呈现出时间依赖性。钙超载可引起线粒体功能障碍及酶的激活,促进膜磷脂酶分解,产生脂肪酸、白三烯、溶血磷脂等,对细胞产生毒害作用。有资料表明［7］,细胞内游离钙离子浓度升高可以激活核酸内切酶,使基因组DNA产生特征性降解,对细胞凋亡起重要作用。本实验的氧化损伤后细胞内游离钙浓度达到高水平，蚤休皂苷干预后，表现为剂量依赖性地降低了其浓度，说明了皂苷具有防止钙离子超载的作用。 　 
       
       由实验结果可以推测，蚤休皂苷可以通过稳定氧化损伤的内皮细胞内的［Ca2+］，达到抑制细胞的凋亡作用以及保护内皮细胞免于氧化损伤，阻止动脉粥样硬化疾病的发生。但是，蚤休皂苷通过哪种途径抑制了H2O2诱导的游离钙升高引起细胞凋亡，还应在蛋白质表达的水平上作进一步的研究。
       【参考文献】
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       ［5］Herrera JA, Arevalo - Herrera M, Shahabuddin AK, et al.Calcium and conjugated linoleic acid reduces pregnancy-induced hypertension and decreases intracellular calcium in lymphocytes ［J］.Am J Hypertens, 2006,19(4):381.
       
       ［6］Antoine F,Faure J E,Dumas C,et al. Differential contribution of cytoplasmic Ca2+ and Ca2+ influx to gamete fusion and egg activation in maize ［J］.Nat Cell Biol,2001,3(12):1120.
       
       ［7］Leiba A, Vald A, Peleg E, et al. Does dietary recall adequately assess sodium, potassium, and calcium intake in hypertensive patients［J］.Nutrition 2005, 21 (4):462.