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       【关键词】  熊胆；,,血管内皮；,,丙二醛；,,一氧化氮
       摘要：目的探讨熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用及抗动脉粥样硬化机制。方法采用脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）体外原代培养方法。通过倒置相差显微镜观察和比较，各组内皮细胞形态，用MTT法检测吸光度值，利用比色法测定细胞上清夜中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitric oxide ，NO）含量。结果 MTT法结果显示：正常组、熊胆组与缺氧－再复氧组比较有显著差异（P<0.01）。缺氧-再复氧组的MDA含量增高，而NO含量降低，正常组和熊胆组中检测结果相反。结论 熊胆冻干粉针剂对缺氧－再复氧损伤的血管内皮细胞有保护作用。
       关键词：熊胆；  血管内皮；  丙二醛；  一氧化氮
       Protective Effects of the Lyophiled Powder Injection of Bear Bile on Vascular Endothelial Cells Induced by Hypoxia-reoxygenation Injury
       JIN Guangxian, REN Xiangshan, LIN Zhenhua, SONG Jingyu*, XUAN Yanhua, JIN Xianguo
       (Department of Medicine,  Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China; Yanbian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jilin, Yanji 133000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of the lyophiled powder injection of bear bile on cultured vascular epithelial cells (VEC) induced by hypoxia-reoxygenation injury, and study the mechanisms of anti -atherosclerosis. MethodsBy using primary culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vitro, the VECs were divided into three groups.The morphological changes of VEC by the inverted microscope, the optical density (OD) value of cells were detected by MTT colorimetric method, content of MDA and NO in the supernatant fluid of cultured cells were detected by spectrophotometry.ResultsThe MTT assay showed that OD value had significant difference (P<0.01) between normal group, bear bile group and hypoxia-reoxygenation group. The MDA content increased and NO content decreased in the hypoxia-reoxygenation group, in contrast, MDA content decreased and NO content increased in the normal and bear bile groups. ConclusionThe results indicate that the lyophiled powder injection of bear bile has protective effects for the HUVEC injury induced by hypoxiareoxygenation injury .
       Key words：Bear bile;  Vascular epithelial cell;  Malondiadehyde;  Nitric oxide
   
　　缺血-再灌注是再灌注心肌损伤、缺血性脑卒中等严重疾病中常见的过程。缺血缺氧极易导致血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)的死亡和严重功能紊乱，从而进一步加重组织损伤。目前关于缺血-再灌注时细胞损伤的机制及对其的保护的研究主要集中在神经细胞和心肌细胞，对VEC的研究极少。本实验通过用连二亚硫酸钠造成缺氧－再复氧模型后用熊胆，观察其抗缺氧作用及其机制。
       　1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  人脐静脉内皮细胞   人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），以酶消化法取得。
       1.1.2  试剂与主要仪器 熊胆冻干粉针剂由延边大学药学院提供。人第八因子相关抗原（Ⅷ因子）是美国 Santa cruz 产品，一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购置于南京建成生物有限公司。M199培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为美国HYCOLONE公司产品；连二亚硫酸钠为沈阳市东兴试剂；MTT为SIGMA公司产品。倒置相差显微镜，日本OLYMPUS产品，37度CO2培养箱是德国SL产品。
       1.2  方法
       1.2.1  脐静脉内皮细胞的分离及培养  按Jaffe等［1，2］的方法略加修改进行。在无菌条件下，取健康产妇分娩后6 h以内的脐带， 灌注0.1%Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ）10～15ml，置37℃水浴中孵育15～20 min。收集含有细胞的酶液，放入离心管中, 1 000 r/min离心10 min, 沉淀中加入含有20％ FBS，50 U/ml肝素、终浓度为2 mg/ml的L谷氨酰胺的完全M199培养液5 ml，充分混合制成细胞悬液，以（1.5~2.0）×104/cm2密度植入培养瓶中，置37℃，5％ 的CO2培养箱中培养，待细胞长成融合状态后进行鉴定。
       1.2.2  分组及药物处理 实验随机分为3个组：分别为缺氧-再复氧组，正常组和熊胆组。熊胆组的熊胆终浓度分别为60，80，120  μg/ml和160 μg/ml。细胞缺氧－再复氧损伤造模法：根据文献［3］略加修改，采用氧清除剂连二亚硫酸钠造成缺氧，种板培养24  h后，各孔弃去培养基，用无糖Earls液洗细胞2次，正常对照孔加入M199培养基；模型孔加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0 mmol/L的无糖Earls液，缺氧4 h后加入完全M199继续培养12 h，造成细胞缺氧再复氧损伤模型。熊胆组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0 mmol/L的无糖Earls液，缺氧4 h后加入终浓度分别为60，80，120，160μg/ml 的熊胆，37℃ 孵育12 h。
       1.2.3  MTT法检测内皮细胞存活率  取对数生长期的细胞制备细胞混悬液，接种于96孔培养板内，细胞浓度为（1～5）×105/ml，每组设8个平行孔，细胞处理同上。细胞置5％CO2培养箱孵育24 h，待细胞贴壁及基本长满时开始做试验。吸弃个孔液体，加入无血清M199培养基100 μl，再加入5 mg/ml MTT工作液20 μl，混匀，37℃孵育4 h。翻板法弃去孔内培养液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）100μl，用微量振荡器摇震10 min，使充分溶解。在酶标仪490 nm处测量各孔OD值，以不加细胞孔调零，酶标仪自动打印结果。
       1.2.4  形态学观察  倒置相差显微镜下直接观察内皮细胞生长情况。
       1.2.5  MDA，NO测定   选用生长良好的HUVEC，制成细胞悬液，以浓度1×105/ml接种于24孔培养板。先用含20％的FBS的M199培养基，培养24 h后换用无血清M199培养基，实验方法同上，然后收集各孔上清液，按照北京邦定生物技术有限公司提供的试剂盒说明，用分光光度计法检测MDA，NO含量。
       1.2.6  统计学处理所有实验数据均以±s表示，应用Excel软件进行t检验。
       　2  结果
       2.1  内皮细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，正常组EC生长旺盛，呈上皮样贴壁生长，细胞呈多角形或长梭形，呈鹅卵石样铺满底层。缺氧-再复氧组EC缺氧2 h后，细胞间隙增大，胞体变小，细胞收缩变圆，胞浆透明，少数细胞悬浮脱落；随着作用时间进一步延长，胞膜边缘不清楚，部分胞膜不完整，细胞出现空泡和颗粒变性，细胞脱落增多，到将近4 h的时候出现拉网现象，而熊胆组的EC形态与正常组基本相似。结果见图1~3。
       图1  正常组细胞×10（略）   
       图2  缺氧再复氧组细胞×10 （略）
       图3  熊胆组细胞×10（略）
       2.2  各组细胞培养液中OD值、MDA、NO含量的检测结果结果见表1。正常组、熊胆组与缺氧再复氧组比较，OD值均有显著差异（P<0.01）。缺氧-再复氧组的MDA含量增高，而NO含量降低；相反，正常组和熊胆组中MDA含量减少，而NO含量增高；缺氧再复氧组与正常组、丹参组比较具有显著性差异（P<0.01）。
       表1  各组内皮细胞中OD值、MDA含量及NO含量的比较（略）
       正常组、熊胆组与缺氧再复氧组比较，*P<0.01
       　　3  讨论
       心血管疾病是人类死亡的首要原因。其中动脉粥样硬化是引起各种心血管疾病的主要原因。研究表明［4］体内许多因素可损伤VEC，以活性氧最重要。活性氧可氧化修饰低密度脂蛋白，生成氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,  OXLDL），进而促进动脉粥样硬化的发展。缺氧再复氧后产生的活性氧可以引发脂质过氧化而导致损伤，引起内皮细胞的功能紊乱，造成血管壁的通透性增加，因而，血浆脂蛋白和脂蛋白渗入内皮下间隙，脂蛋白进入这一间隙后被氧化成为OXLDL，引起动脉粥样硬化［5］。熊胆作为传统的名贵中药，具有清热、平肝、镇痉止痛、明目去翳、健胃利胆、杀虫等作用。熊胆粉中胆酸类主要成分是去氧胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸钠。牛磺去氧胆酸是熊胆粉特有的主要成分，含量达25％～68％［6］。MTT比色法［7］是大多数药物敏感性实验中所采用的简便，快速的方法之一。结果表明药物浓度在60～160 μg/ml范围内对缺氧损伤的EC具有保护作用。NO是内皮细胞释放的血管舒张因子，对动脉粥样硬化有防治作用。NO是VEC损伤的一个敏感的标志物［8］。在人体内NO是通过NO合成酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）由L-精氨酸氧化产生。NOS有3种，其中eNOS主要表达于内皮细胞，是NO合成的主要限速因素。实验中发现用缺氧再复氧组的内皮细胞NO含量明显减少，表明EC功能受损。用熊胆干预后的HUVEC，与缺氧组比较 NO含量升高。缺氧组内皮细胞经缺氧处理4 h后NO含量有所减少，这可能与脂质过氧化物抑制eNOS活性和直接灭活NO有关。研究表明［9］脂质过氧化的内皮细胞eNOS蛋白表达降低，而内皮细胞内一氧化氮合成酶主要为eNOS，另外超氧阴离子与NO作用，还生成其它的一些硝基化合物，使NO减少［10］。因此脂质过氧化的内皮细胞中的一氧化氮含量降低。而给药组一氧化氮含量减少的不明显的原因可能为① 熊胆作为抗氧化剂减少氧自由基的生成，减少超氧阴离子对NO的破坏；②熊胆可能直接激活NOS，从而提高NO含量。 Quillen等［11］用缺氧条件下培养的HUVEC实验发现，缺氧可直接作用于EC，使其合成释放NO减少，本研究结果与之相符。缺血缺氧的氧自由基增加，O2与NO生成NO3，导致NO代谢加快，NO含量减少。总之，熊胆通过减轻内皮细胞缺氧再复氧损伤及减少脂质过氧化物，减轻细胞的氧化损伤，平衡内皮细胞分泌的NO含量来达到防止内皮细胞进一步损伤及动脉粥样硬化进一步发展的目的。
       　　参考文献：
       ［1］  Jaffe EA,takahara T,Yamaguchi N,et al. Calture of human endothelial cells derived  from umbilical veins indentification by mrophdogic and immunology criteria［J］.J Clin Invest,1973,52:2745．
       ［2］  钱  勇，张  励.内皮细胞生长因子和肝素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响［J］.眼科研究.2003，21（1）：26.
       ［3］  闫彦芳，张  壮.三七总皂苷及其主要成分对血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2002, 8(1); 34.
       ［4］  任德成.血管内皮细胞的氧化性损伤机理［J］.心血管病学进展，2002，23（4）235.
       ［5］  夏  敏.氧化应激与动脉粥样硬化［J］.国外医学内科学分册，2001，28(8): 323.
       ［6］  张启明，段晓建，严克东，等.高效液相色谱法直接测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛黄鹅去氧胆酸的含量［J］.药物分析杂志，1993，13（5）：321.
       ［7］  丘仑兴. 用MTT改良法检测肿瘤细胞化疗药物敏感性［J］.江西医学院学报，1997，37（20）：21.
       ［8］  阎西艴，张福兴.血管内皮功能不全及其防治［J］.岭南心血管病杂志，2001，7（1）：48.
       ［9］  张泉三，董国雄，张杜华，等.维生素C对脂质过氧化损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用［J］.中国动脉硬化杂志，2002，10（3）：225.
       ［10］  Li C, Jackson RM, Reactive apecies mechanisms of cellular hypoxia-reoxy genation injury ［J］.Am Jphysiol cell Physiol. 2001, 282: C227.
       ［11］  McQuillen LP, Leung GK, Marsden PA, et al. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and postrans-criptional mechanisms. Am J physiol, 1994, 267(5): 1921.
       (延边大学医学部，吉林 延吉  133000；  延边中医医院，吉林 延吉  133000）