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       【摘要】 
       目的探讨不同宫内缺氧时程对胚胎大鼠神经干细胞增殖的影响及当归注射液的保护作用。 方法将孕15 d的SD大鼠随机分为9组：对照组、缺氧3 h组、缺氧6 h组、缺氧9 h组、缺氧12 h组、当归3 h组、当归6 h组、当归9 h组和当归12 h组，每组5只。所有当归组孕鼠经尾静脉注入当归注射液，然后用低张性缺氧模型致胎鼠宫内缺氧；所有缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组；对照组只注盐水，不缺氧。取胎鼠大脑组织，作Nestin免疫组织化学染色、图像分析。结果缺氧3 h组、缺氧6 h组和缺氧9 h组阳性细胞较对照组染色增强，数量增多，缺氧12 h组阳性细胞较对照组减少，各缺氧组间比较有统计学差异；除当归12 h组外，其余各当归组阳性细胞较相应缺氧组染色减弱，数量减少；当归12 h组与缺氧12 h组间比较无统计学差异（P＞0.05）。结论一定时程、一定浓度的缺氧可以刺激神经干细胞进入增殖状态，其增殖的强弱与缺氧时程有关，缺氧6 h时达到增殖高峰, 缺氧9 h开始降低；长时程缺氧(12 h)会导致神经干细胞减少；当归对一定时程缺氧的胚胎大鼠神经干细胞有一定保护作用，而在缺氧12 h时失去保护作用。
       【关键词】  神经干细胞； 缺氧；胚胎；增殖；当归
       The Influence of Intrauterine Hypoxia in Different Time on Rat Embryo Neural Stem Cells and the Protective Effect of Chinese Angelica
       CHEN Yan, CAO Bing, MEI Xinming, CAO Kun, YU Hong
       1.Yunnan College of TCM, Kunming 650021, China; 2.The Second People"s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, China; 3.Medical College of Luzhou, Luzhou 646000, China
       Abstract:ObjectiveTo study the influence of intrauterine hypoxia in different time on proliferation of embryo neural stem cells（NSE） and the protective effect of Angelica injection.MethodsThe pregnant SD rats in 15 days were randomly divided into 9 groups: control group (CG), hypoxia 3 h group(HG-3 h), hypoxia 6 h group(HG-6 h), hypoxia 9 h group(HG-9 h),hypoxia 12 h group(HG-12 h),Angelica group 3 h(AG-3 h), Angelica group 6 h(AG-6 h),Angelica group 9 h(AG-9 h),Angelica group 12 h(AG-12 h).Every group had 5 pregnant rats. The pregnant rats in Angelica groups were injected Chinese angelica injection via tail vein, and then the hypoxia model was used to cause embryo hypoxia in intrauterine. In hypoxia groups, 0.9% normal saline injection replaced Chinese angelica injecta, was injected in pregnant rats, and others were the same as Angelica group. The pregnant rats in control group were also injected 0.9% normal saline, but were not suffered hypoxia. After drawing materials, the cerebrum of rat embryo was carried out the immunohistochemical staining of Nestin.ResultsIn HG-3h, HG-6h,HG-9h,the immunoreactive positive cells of Nestin were deeper and more than the positive cells in CG. But the positive cells in HG-12 h were lighter and less than those in CG. And there had statistical difference between every hypoxia group. The positive cells of Nestin in AG-3 h were lighter and less than those in HG-3 h, the same as in AG-6 h and in AG-9 h. But there had no statistical difference between AG-12 h and HG-12 h （P＞0.05）.ConclusionHypoxia in some time and concentration (11%±1%) can stimulate embryo NSC into proliferation, and the degree of proliferation is related with time of hypoxia. NSC achieved the proliferation peak at hypoxia 6h and its proliferation ability was decreasing at hypoxia 9h. Long time hypoxia can cause reduction of NSC, as hypoxia 12 h.Chinese angelica has a certain protective function on the embryo rat NSC of hypoxia in some time, but lost this effect at hypoxia 12 h.
       Key words:Neural stem cell;  Hypoxia;  Embryo;  Proliferation;  Angelica
       
       宫内缺氧可导致围产期胎儿严重的大脑损伤，是新生儿神经系统后遗症的常见原因，而神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的增殖、分化是神经系统损伤修复的关键步骤。目前有研究表明，一定程度缺氧可增强NSCs的增殖能力。Yang等［1］研究表明缺血缺氧能增强围产期大脑室下区神经干细胞的再生能力。该实验小组［2］在前期的研究中发现宫内缺氧1 h可刺激神经干细胞增殖，但随着缺氧时间的延长将对NSCs产生怎样的影响目前尚未见报道。因此，研究不同缺氧时程对NSCs的影响，可为临床有宫内缺氧的胎儿的诊断、预后评价提供一定的理论依据。
       
       目前宫内缺氧在临床治疗上方法比较局限，疗效不确定。当归作为妇科要药已有数千年历史，现代医学研究发现当归具有解除血管平滑肌痉挛、促进新生血管的形成、抗氧化及抗衰老等作用。为此，本实验设计了当归对不同宫内缺氧时程胚胎大鼠神经干细胞的影响，以期探明当归对宫内缺氧胚胎大鼠神经干细胞的有效作用范围，用以指导临床治疗。
       1 材料
        云南系健康成年雌性Wistar大鼠45只（体重250～300 g）由泸州医学院动物中心提供。250 g/L当归注射液购于湖北医科大学附属第二医院药剂科（批号：060926），小鼠抗Nestin购于Chemicon Company，免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。
       2 方法
        将45只大鼠分别与雄鼠配种，于第2天早晨发现阴栓记为怀孕0 d，单独饲养雌鼠至孕期15 d。将孕鼠随机分为9组：对照组(CG)，缺氧3 h组(HG-3 h)，缺氧6 h组(HG-6 h)，缺氧9 h组(HG-9 h)，缺氧12 h组(HG-12 h)，当归3h组(AG-3 h)，当归6h组(AG-3 h)，当归9 h组(AG-3 h)和当归12 h组(AG-3 h)，每组5只。所有缺氧组孕鼠先经尾静脉缓慢注射0.9%生理盐水8 ml/kg体重，然后放入装有200 g钠石灰(可吸收CO2)的4 000 ml容量的玻璃缸内，密闭缸盖，并维持缸内O2浓度在12%～10%之间（玻璃缸与测氧仪连接），直至达所需时间，再打开玻璃缸盖复氧2 h。然后脱颈处死孕鼠，快速剖腹取出胚胎，剪破胚胎颅骨，暴露部分脑组织后放入10%的中性福尔马林中固定12 h。所有当归组孕鼠用250 g/L的当归注射液（8 ml/kg体重）代替缺氧组的生理盐水，其余处理方法同缺氧组。对照组孕鼠经尾静脉缓慢注射0.9%生理盐水8 ml/kg体重，不缺氧，2 h后按缺氧组方法取材固定。各组随机选取4只胎鼠的大脑组织作经常规石蜡切片（冠状切面，片厚4 μm）、再进行免疫组化染色、显微镜下以脑室系统周围为观察对象、照相、图像分析。
       3 结果
        对照组Nestin免疫组化反应阳性细胞胞质染为棕黄色，部分细胞有细而短的突起。阳性细胞呈区域性分布，主要集中在胚胎发育的中轴部位如：侧脑室、第三脑室、中央导水管和第四脑室的室管膜上皮层和室管膜下区，室管膜上皮层多表现为复层上皮样排列（见图1）。
       
       缺氧组Nestin免疫组化反应阳性细胞的分布与对照组相似，但与对照组相比：除缺氧12 h组以外，其余各缺氧组阳性细胞染色增强，数量增多，而且有突起的细胞增多，突起变长，其积分光密度值（IOD）均增大；而缺氧12 h组的阳性细胞染色较对照组明显减弱，数量减少。各缺氧组间比较：缺氧6 h组较缺氧3 h组阳性细胞染色增强，数量增加，缺氧9 h组较缺氧6 h组阳性细胞染色减弱，数量减少（见图2～5）。
       当归治疗组Nestin阳性细胞的分布与对照组相似，与缺氧组相比：除当归治疗12h组外，其余各治疗组阳性细胞染色较相应缺氧组减弱，数量减少，有突起的细胞减少，突起变短（见图6～9），其IOD值均减小（P＜0.05）。见表1。当归治疗12 h组阳性细胞染色与缺氧12 h组无统计学差异（P＞0.05）。表1  各组Nestin免疫组化阳性细胞IOD值(略)
       4 讨论
        有研究表明缺氧能诱导神经干细胞增殖。Plane JM等［3］发现缺血缺氧（10%O2 ）可促进SVZ和周围梗塞纹状体区NSC的增殖。余鸿等［2］发现宫内缺氧1h可刺激15 d胎鼠大脑NSC表达Nestin增强，阳性细胞增多。Nestin既是NSC的标志物，其表达增强又与NSC的增殖密切相关。史冬梅等［4］在研究中发现，NSCs从核膜溶解到胞质分裂，其Nestin表达明显增多，尤以末期最高。因此，NSC表达Nestin的增强，说明其进入了分裂期，是细胞在增殖的表现。本实验中，宫内缺氧3，6，9 h组胎鼠大脑NSC表达Nestin比对照组增强、阳性细胞增多，说明缺氧刺激胎鼠大脑中更多的NSC进入了增殖期,这可能是神经系统对缺氧刺激的一种保护性应激反应。然而，Romanko等［5］和Brazel等［6］则认为缺氧可以损伤SVZ区的神经祖细胞，诱导NSC凋亡。王煜等［7］人研究也发现体外缺氧培养条件下胚胎NSC凋亡增加。赵舒武等［8］以5%和10%的氧含量培养大鼠胚胎NSC，结果显示缺氧可抑制NSC的增殖，促进其凋亡，且与缺氧程度成正相关。本实验也发现宫内缺氧12 h组胎鼠大脑NSC表达Nestin比对照组减弱、阳性细胞减少，说明宫内持续缺氧12 h可使NSC数量减少。综合分析缺氧引起NSC的增殖/凋亡的两种结论，可能是由于缺氧时间的不同、O2浓度的不同以及检测时间点的不同。因此，结合本实验研究结果，我们认为宫内缺氧（11%±1%）3～9 h可刺激15 d胚胎大鼠NSC的增殖，而缺氧达到12 h时，NSC即表现为坏死或凋亡。这与孙崇毅等［9］的研究有一致性，他们在培养NSC的研究中发现，缺氧4 h（强度适合）可以促进细胞的增殖；而长时间缺氧(12 h)反而会抑制细胞的增殖。并且本实验还发现，在缺氧3，6，9 h时虽然NSC都表现为增殖，但其增殖的情况不一样。NSC增殖在缺氧6h时达到高峰，在缺氧9 h时其增殖能力已经开始下降。缺氧9 h组Nestin阳性细胞较缺氧6 h组数量减少，染色变浅。这说明缺氧对NSC的作用是一个动态过程，短时间缺氧（3，6，9 h）会引起NSC增殖，长时间缺氧（12 h或以上）会导致NSC凋亡；可能在缺氧6 h时NSC的增殖达到高峰。
       
       当归为血中圣药，在方剂中的应用频率甚高。目前已证明，当归对心血管系统、造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等方面均有肯定的药理作用。本实验将当归应用于宫内缺氧，结果发现当归治疗3，6，9 h组胎鼠大脑Nestin阳性细胞的IOD值较相应缺氧组胎鼠的减小。如前所述，缺氧3，6，9 h组胎鼠大脑NSC表达Nestin的细胞增多、染色增强是由于缺氧对NSC的刺激所致。虽然缺氧时NSC的增殖、分裂可能是神经系统对缺氧刺激的一种保护性应激反应，但是这种应激反应是由损害因素“缺氧”所致，而且这种增殖是超越正常发育状态的增殖。因此，如能减弱这种损害因素的影响，这种超常态的增殖必然减弱。所以缺氧3，6，9 h的治疗组的Nestin阳性细胞减小，说明当归注射液减弱了缺氧刺激引起的NSCs的增殖，提示当归可以改善宫内缺氧状态，从而对宫内缺氧胎鼠有保护作用。这与熊杰等［10］报道当归有效成分丁基苯酞（NBP）可减弱缺氧刺激引起的NSC的增殖基本一致。但是，本实验结果也发现缺氧12 h治疗组胎鼠大脑的Nestin阳性细胞的IOD值与相应缺氧组间无统计学差异，说明此时当归已失去保护作用。我们分析认为主要的原因有两个方面：一是由于缺氧的时程过长，导致细胞的坏死或凋亡；二是由于当归的有效作用时间（半衰期）已过，导致对后期的缺氧失去保护作用。综合各当归治疗组的结果，我们认为当归注射液对一定时限的宫内缺氧（3，6，9 h）胎鼠神经干细胞有保护作用，而当归注射液对长时程的缺氧（12 h）已失去保护作用。关于当归对缺氧的保护作用机制，根据已有的研究分析可能主要通过扩张血管、抑制子宫平滑肌收缩，从而改善胚胎大鼠的缺氧状态，并通过清除氧自由基，减少神经干细胞的钙超载，从而导致神经干细胞内Nestin合成减少，即减弱NSC的增殖。但在缺氧12 h时，NSC受损伤过重，细胞出现死亡，当归对其的保护作用消失。
       【参考文献】
         　　［1］Yang Z, Levison SW. Hypoxia/ischemia expands the regenerative capacity of progenitors in the perinatal subventricular zone［J］.Neuroscience, 2006，139(2): 555.
       
       ［2］余鸿，程基焱，杨小红，等.鼠胚神经干细胞增殖对缺氧的反应及当归的保护作用［J］.中国临床康复，2005，9（34）：20.
       
       ［3］Plane JM, Liu R, Wang TW,et al. Neonatal hypoxic-ischemic injury increases forebrain subventricular zone neurogenesis in the mouse［J］.Neurobiol Dis. 2004 , 16(3):585.
       
       ［4］史冬梅，周畅，谢佐平.神经干细胞有丝分裂过程中Nestin表达变化［J］.神经解剖学杂志，2003，19（2）：119.
       
       ［5］Romanko MJ, Rothstein RP, Levison SW. Neural stem cells in the subventricular zone are resilient to hypoxia/ischemia whereas progenitors are vulnerable ［J］.J Cereb Blood Flow Metab. 2004,24(7): 814.
       
       ［6］Brazel CY, Nunez JL, Yang Z,et al. Glutamate enhances survival and proliferation of neural progenitors derived from the subventricular zone［J］.Neuroscience. 2005,131(1):55.
       
       ［7］王煜，肖波.缺氧诱导胚胎大鼠神经干细胞凋亡的初步研究［J］.中国病理生理杂志，2003，19（4）：544,545,571.
       
       ［8］赵舒武，高英茂，张晓丽，等.缺氧对离体培养神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响［J］.神经解剖学杂志，2006，22（1）：50.
       
       ［9］孙崇毅，姚猛，刘庆鹏，等.缺氧培养对大鼠神经干细胞体外增殖影响及其机制的研究［J］.现代生物医学进展，2006，6（11）：18.
       
       ［10］熊杰，冯亦璞.丁基苯酞对局灶性脑缺血过程中线粒体损伤的保护作用［J］.药学学报，2000，35(6)：408.