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       【摘要】 
       目的观察百草枯（PQ）急性中毒大鼠所致肺损伤(ALI)时一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的变化，探讨川芎嗪对急性百草枯中毒所致肺损伤的保护作用。方法将50只SD大鼠随机分成5组，空白组、阴性对照组、阳性对照组、川芎嗪低剂量组和川芎嗪高剂量组。观察大体标本，组织病理以及生物学标志：肺湿/干重比、肺泡灌洗液中性粒细胞比和蛋白含量。同时测定肺组织NO含量和iNOS活性。结果与阴性对照组相比，川芎嗪低剂量组肺组织病理显示肺淤血、肺水肿明显减轻。其生物学标志均降低(P＜0.05或P＜0.01)，NO和iNOS也降低(P<0.01)。结论NO及iNOS在百草枯所致大鼠肺损伤中起重要作用，川芎嗪能降低NO及iNOS水平，减轻百草枯中毒大鼠肺组织损伤。
       【关键词】  川芎嗪； 百草枯；肺损伤；一氧化氮；一氧化氮合酶
       Effect of Ligustrazine on NO and iNOS in Paraquat-induced Acute Lung Injury in Rats
       LIU Huifang, ZHAO Yanyan, CUI Yuying, CHEN Chunsheng
       1.Health Professional Technical College，Baoding 071000, China; 2.Medical Experiment Centre of Hebei University, Baoding, Hebei 071000, China
       Abstract：ObjectiveThe variance of NO and iNOS in Paraquat-induced acute lung injured rats was investigated, and the protection of ligustrazine on rat acute lung injury was approached.Methods50 Sprague- Dawley (SD) rats were randomly divided into five experimental groups: blank group, negative control group, positive control group, ligustrazine low-dose group(LDG), ligustrazine high-dose group(HDG). Macroscopic and histopathological examinations were performed and biological indexes were measured for the lung specimens. The indexes included lung wet weight/dry weight, the rats of neutrophils and protein content in the pulmonary alveolar lavage fluid. In the mean time, the contents of lung tissue homogenate NO and iNOS were measured. ResultsCompared with negative control group, lung congestion and lung edema of ligustrazine low-dose group were mitigated. Lung wet weight/dry weight, neutrophil infiltration, and protein content were decreased (P＜0.05 or P＜0.01), and biological indexes of lung injury and the contents of NO and iNOS were significantly decreased (P＜0.05 or P＜0.01). ConclusionNO and iNOS play important roles in lung injury of poisoned rats. Ligustrazine can ameliorate the lung injury and decrease the concentrations of NO and iNOS.
       Key words：Ligustrazine;   Paraquat;   Pulmonary injury;   Nitric oxide(NO);  Inducible nitric oxide synthase (iNOS)
        百草枯（又名Paraquat, PQ，克无踪，克灭踪等）是有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂，随着其广泛使用，引起大量中毒事件的发生，死亡率可高达85%～95%［1］ 。百草枯在肺组织中浓度比血浆浓度高10～90倍。5～7h达到肺内血浆浓度峰值，存留时间也较久，因此肺损伤最为严重，患者多死于呼吸窘迫综合征［2］ 。人们尝试用各种方法治疗百草枯中毒，但迄今尚无特效解毒剂。
        川芎嗪（ligustrazine, Lig）是从伞形科植物川芎中提取的一种生物碱单体4-甲基吡嗪，具有抑制自由基产生、提高内源性超氧化物歧化酶（SOD）活性、清除氧自由基、免疫调节、抑制炎症和抗纤维化等多种生物学作用［3］ ，临床主要用于心脑血管疾病的治疗，最近有文献报道川芎嗪用于呼吸道疾病如急性肺损伤、气管炎等的治疗［4,5］ ，但其能否对抗百草枯中毒所致的肺损伤尚未见报道。我们拟就该药物在百草枯中毒治疗中的价值作一探索，为抢救百草枯急性中毒提供新的治疗药物。
       1  材料
       1.1  实验动物及分组
       健康SD大鼠(250～300g) 50只，雌雄各半，河北医科大学实验动物中心提供。称重后，空白对照组腹腔注射生理盐水30 mg/kg，其他组腹腔注射20%百草枯溶液30 mg/kg复制百草枯急性中毒模型。动物分组如下：①空白对照组(NS)：腹腔注射生理盐水4 mg/kg。②阴性对照组(PQ)：腹腔注射生理盐水4 mg/kg。③阳性对照组(D)：腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg。④川芎嗪低剂量组(LDG)：腹腔注射川芎嗪溶液4 mg/kg。⑤川芎嗪高剂量组(HDG)：腹腔注射川芎嗪8 mg/kg。以上5组动物每日均给药2次，连续给药3 d。
       1.2 仪器与材料
       20%PQ浓缩液（英国捷利康有限公司农药部）；川芎嗪注射液（北京市永康药业有限公司）；地塞米松磷酸钠注射液（郑州卓峰制药厂）；一氧化氮试剂盒，一氧化氮合酶测定试剂盒，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（均由南京建成生物工程研究所提供）。SHA-BA型双功能水浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；XW-80A型涡旋混匀器（上海沪西分析仪器厂）；TDL-5-A型离心机（上海安亭科学仪器厂）；501A型超级恒温器（上海实验仪器厂有限公司）；Stat Fax-2100型酶标仪（AWARENESS TECHN- OLOGYING）;TEK-11全自动三分群血细胞分析仪（江西博康科技有限公司）；DHG-9143BS-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；CKX41倒置生物显微镜（日本OLY -MPUS）。
       2 方法
       2.1 肺组织湿重/干重比、肺泡灌洗液（BALF）中细胞计数比、蛋白含量测定以及肺泡通透指数计算
       开胸暴露出气管和双肺，夹闭右主支气管，用静脉输液针接注射器从气管缓慢注入无菌生理盐水灌洗左肺，共3次，第1次2 ml，以后两次各1 ml。取3 ml BALF以1 500 r/min离心15 min，上清液-70℃保存，灌洗液用全自动三分群血细胞分析仪细胞计数。用试剂盒测定蛋白含量。计算肺通透指数(肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白，LPI)。立即取出右肺，右肺下叶留做病理和生化指标测定。剩余右肺组织迅速用吸水纸吸取表面水分和血液，电子天平称湿重后，置烤箱(80℃，24 h)烤至恒重，称干重，计算湿/干重比。
       2.2 NO测定
       精密称取一定量的肺组织，在持续95% (体积分数)O2-5% (体积分数)CO2，37℃恒温条件下振荡孵育2 h，取孵育液100 μl，按试剂盒说明严格操作。
       2.3 肺组织iNOS活性的测定
       速取肺组织适量，按1∶5(W/V)加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，用考马斯亮蓝试剂盒进行蛋白定量，iNOS试剂盒测定提取液iNOS活性。
       2.4 组织学检查
       如“2.1”取右肺下叶少许，经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后用显微镜观察肺组织损伤情况。
       2.5 统计学处理
       实验资料以±s表示。两组以上资料采用One-way ANOVA分析、组间Newman-Student-Keuls检验进行统计学处理；两组资料采用Student"s t test处理。P<0. 05为差异有统计学意义。
       
       3 结果
       3.1 肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量测定
       以及肺泡通透指数研究结果表明，与NS组相比，PQ组肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量均显著增加(P＜0.01）；与PQ组相比，除HDG组肺湿/干重比、中性粒细胞比无统计学意义，其他各组肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量均降低(P＜0.05或P＜0.01)，因此百草枯所致肺损伤可使肺水增多，蛋白含量增多，并引起中性粒细胞在肺内聚集。用低剂量川芎嗪干预治疗后使这些指标显著下降，而高剂量效果不佳。结果见表1。表1  肺湿/干重比和肺泡灌洗液中性粒细胞比、蛋白含量以及肺泡通透指数的变化（略）
       3.2 肺组织NO和iNOS的变化研究
       结果表明，与NS组相比，PQ组肺组织NO浓度和iNOS活性显著增高(P＜0.01），说明百草枯可引起肺组织产生大量NO，并使肺组织iNOS活性增高。应用川芎嗪或地塞米松进行干预治疗后，D组和LDG组肺组织NO浓度和iNOS活性较PQ组明显降低(P＜0.01，P＜0.05），HDG组NO浓度和iNOS活性虽然有所降低，但是没有统计学意义。因此低剂量川芎嗪可抑制肺组织产生NO并抑制iNOS活性，而高剂量川芎嗪低几乎无效。结果见表2。表2  肺组织中NO、iNOS含量的变化（略）
       3.3 组织病理学改变
       正常大鼠肺呈粉红色，色泽光亮，质地柔软，中毒大鼠肺组织体积肿胀增大，呈暗红色，质地中等，可见边界清晰的大片淤血，川芎嗪低剂量组肺色泽明显变浅，水肿减轻，肺呈小片状淤血。川芎嗪高剂量组改善不显著。肺组织病理学检查可见：阴性对照组肺间质弥漫性出血，肺泡腔内可见大量红细胞渗出和巨噬细胞浸润，并伴有肺泡上皮细胞增生；阳性对照组肺充血稍减轻；而川芎嗪低剂量组肺充血明显减轻；川芎嗪高剂量组肺损伤改善不明显（见图1～4）。此病理检测结果与“3.1”，“3.2”项生物指标检测结果一致。
       4 讨论
        NO是生物体内一种结构简单的双原子自由基，同时也是新型信号分子、炎症介质和免疫调节因子［6］。在正常的肺内主要发挥舒张血管和气道平滑肌的作用。NO作为第二信使主要由一氧化氮合酶(NOS)生成，NOS有3种，原生型(nNOS)、内皮型(enNOS)、诱导型(iNOS)。前二者主要由气道上皮细胞、肺血管内皮细胞产生；第三种由内毒素及多种炎症细胞因子刺激合成，常存在于肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞及气道上皮细胞。iNOS可诱导机体产生大量NO，对组织细胞具有损伤作用，参与许多疾病（包括哮喘、急性肺损伤等）的发病过程。
        本研究也表明，百草枯所致急性肺损伤时肺组织NO 和iNOS都显著增加。川芎嗪低剂量（4 mg/kg）可使ALI的肺湿/干重比、肺泡灌洗液中的中性粒细胞比、蛋白量、肺泡通透指数等肺损伤标志均较阴性对照组明显改善，肺组织病理也显著减轻。同时NO和iNOS也显著降低。由此可见川芎嗪对百草枯所致急性肺损伤具有一定的治疗作用，如果配合其他方法进行全方位治疗，争取延长患者生命，为进一步降低死亡率创造必要的条件。
       【参考文献】
         　　［1］Suntres ZE. Role of antioxidants in paraquat toxicity［J］. Toxicology,2002, 180(1):65.
       
       ［2］Ito S, Kudo K,Imamura T, et al.Detection of drugs and poisons in postmortem tissues-determination of paraquat in tissues of rabbits buried underground［J］.Nippon Hoigoku Zasshi,1997,51(2):83.
       
       ［3］张廷伟.盐酸川芎嗪的药理作用及临床应用［J］.医药导报,2006,25(11):1179.
       
       ［4］高秀霞,杜海科,王奕飞，等. 川芎嗪对染矽尘大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响［J］.卫生研究,2006,35(4):406.
       
       ［5］陈径,杨莉,金蕊，等. 川芎嗪对哮喘大鼠NF2JB表达及气道炎症的影响［J］.现代医学,2005，33（6）：351.
       
       ［6］王粤, 李金宝, 邓小明，等. 吸入一氧化氮对油酸型急性呼吸窘迫综合征犬的治疗作用［J］. 第二军医大学学报, 2002, 23(7): 778.