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       【摘要】 
       目的观察川芎嗪对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖中蛋白激酶C（PKCζ）-细胞外信号调节激酶（ERK1/2）通路的影响。方法建立AngII诱导的VSMC增殖模型，测定细胞增殖活度，免疫细胞化学法检测PKCζ与ERK1/2表达。结果与对照组比较，AngⅡ组细胞增殖活度显著增高，PKCζ与ERK1/2表达显著高于对照组(均P<0.01)。中、高剂量川芎嗪组的细胞增殖活度明显降低（P<0.05或P<0.01），PKCζ与ERK1/2表达亦明显低于AngⅡ组（P<0.01），与低剂量川芎嗪组相比亦有显著差异，说明川芎嗪的抑制作用具有量-效关系。结论川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMC增殖有显著抑制作用，其机制与抑制PKCζ-ERK1/2通路有关。
       【关键词】  川芎嗪；血管平滑肌细胞；蛋白激酶C； 细胞外信号调节激酶
       Effects of Tetramethylpyrazine on PKCζ-ERK1/2 Signal Pathway in Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Induced by AngII
       SUN Yinping, WANG Xing, ZHANG  Da-wei, GUO Yong, WANG Yuxia
       Xinxiang Medical College,  Xinxiang 453003,China
       Abstract：ObjectiveTo  investigate  the effects of tetramethylpyrazine(TMP) on   PKCζ-ERK1/2 signal pathway in proliferation of vascular smooth muscle cells induced by AngII .MethodsProliferating model of VSMC induced by Ang II was established. Cell proliferating activity was detected, and the expression of PKCζ and ERK1/2 was detected by immunocytochemical technique. ResultsCell proliferation activity of AngⅡ group was higher than that in control group（P<0.01）, PKCζ and ERK1/2 expression were higher than those in control group（P<0.01, respectively）. While treatment with TMP in middle and high dose，cell proliferating activity, PKCζ and ERK1/2 expression were obviously lower than those in AngII group（P<0.05 or P<0.01）. ConclusionThe Ang II-induced VSMC proliferation can be inhibited by TMP, the mechanism may be related to inhibition of the PKCζ-ERK1/2 signal pathway.
       Key words：Tetramethylpyrazine;   Vascular smooth muscle cell;   Protein kinase C;   Extracellular signal regulated kinase
        血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖是血管再狭窄的一个重要病理特征［1］。蛋白激酶C（protein kinase C, PKCζ）与下游的细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK1/2）是多种信息分子胞内信号传递的共同通路［2］。研究显示［3］，PKCζ-ERK1/2通路参与血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）诱导的VSMC增殖。中药川芎的主要活性成分-川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）可以抑制VSMC增殖，但其作用机制目前尚不十分清楚。本实验应用AngⅡ建立VSMC增殖模型，观察PKCζ与ERK1/2表达的变化及川芎嗪对其的影响，探讨川芎嗪对VSMC增殖的抑制效应及作用机制。
       1  材料与方法
       1.1  动物及试剂 
       体重为120～150 g的健康雄性SD大鼠 (河南省实验动物中心)。细胞培养器材、胰蛋白酶（华美生物工程公司）；AngⅡ（Merck公司）；盐酸川芎嗪注射液（无锡市第七制药公司）；DMEM培养基（Sigma）；Sm-actin免疫试剂盒（Santa Cruz）；PKCζ、ERK1/2抗体（武汉博士德）；其它试剂为分析纯产品。
       1.2 VSMC培养与鉴定
        
       按组织贴块法以含20%胎牛血清的DMEM进行原代培养。光镜以及倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形，生长至融合状态时呈现特有的峰与谷特点，同时经sm-actin免疫细胞化学染色进行VSMC鉴定，细胞阳性率在95％以上。
       1.3 分组
       选择4～6代VSMC进行实验。分组①对照组(control)：不加特殊试剂，仅给予无血清DMEM培养；②AngⅡ组：AngⅡ 10-7mol·L-1培养；③TMP低剂量组：20 mg·L-1TMP孵育30 min后再加AngⅡ培养；④TMP中剂量组：200 mg·L-1TMP孵育30 min后再加AngⅡ培养；⑤TMP高剂量组：2 000 mg·L-1 TMP孵育30 min后再加AngⅡ培养。
       1.4 MTT法检测细胞增殖活度  
       按上述方法接种于96孔培养板中培养24 h后终止，换无血清DMEM培养24 h，分组（同前）继续培养24 h，每孔加入MTT溶液20 μl，吸去培养上清液，加入二甲基亚砜振荡；选择490 nm波长，在酶标仪上测定吸光度值（A值）。
       1.5 免疫细胞化学法检测
       PKCζ与ERK1/2的表达0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为5×104·L-1，接种于6孔培养板中培养24 h，无血清DMEM培养24 h，分组（同前）继续培养24 h。细胞爬片用PBS冲洗3次，冷丙酮固定后SABC法测定PKCζ与ERK1/2的表达。采用HPIAS-10009型病理图文分析系统进行图象分析，每张涂片400×显微镜下随机选择4个视野，计算其平均灰度值。
       1.6 统计学处理 
       数据用±s表示。计算机统计软件分析SPSS11.0，采用One-way ANOVA分析，两两比较LSD检验。
       2 结果
       2.1 TMP对培养的VSMC增殖活度的影响
       AngⅡ组细胞增殖活度明显高于对照组（P<0.01）；与AngⅡ组比较，小剂量组增殖活度无显著差异，但有下降趋势，中、高剂量TMP组VSMC的细胞增殖活度显著降低（P<0.05），说明TMP能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖效应。结果见表1。
       2.2 TMP对VSMC PKCζ表达的影响
       以细胞浆或胞核出现棕黄色反应产物为阳性表达。计算机图象分析结果显示，AngⅡ组PKCζ表达显著高于对照组(P<0.01)，与AngⅡ组比较，低剂量TMP处理后PKCζ表达呈下降趋势，中、高剂量TMP处理，PKCζ表达水平显著降低（P<0.01），并且随着TMP浓度增加，PKCζ表达显著降低。结果见表1。
       2.3 TMP对VSMC ERK1/2表达的影响
       以细胞浆或胞核出现棕黄色反应产物为阳性表达。经计算机图象分析，AngⅡ组ERK1/2表达显著高于对照组 (P<0.01)，与AngⅡ组比较，TMP低剂量组ERK1/2表达水平呈下降趋势，无明显差异；中、高剂量TMP处理，ERK1/2表达显著降低（P<0.01）；低剂量组相比亦有显著差异，说明其抑制作用具有浓度依赖性。结果见表1。表1  TMP对VSMC增殖活度、PKCζ与ERK1/2表达的影响（略）
       3 讨论
       
       TMP是从中药川芎中分离提纯的有效成分，其化学结构为四甲基吡嗪。研究表明［4，5］TMP具有扩张冠状动脉、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注损伤降低血压、降低肺动脉高压以及抑制血管平滑肌细胞增殖等多种心血管药理作用。TMP可能通过抑制VSMC增殖发挥抗血管再狭窄作用，但其具体分子机制尚不清楚。
       
       血管平滑肌细胞在各种细胞外信息分子作用下，经过细胞内信号转导系统到达核内，诱导一系列与VSMC增殖相关基因活化、蛋白质合成，最终导致VSMC增殖。PKC是参与多种类型细胞增殖的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，分为α、β、ζ等多种亚型，是细胞内信息传递中的重要分子。ERK1/2属于丝裂素活化蛋白激酶家族中一个重要成员，是介导细胞增殖的重要途径。活化的ERK1/2可转位入核，激活多种转录因子，引起基因转录和蛋白质合成，导致细胞的增殖和肥大［6］。
       本组结果显示，AngⅡ显著增加细胞增殖活度，川芎嗪呈剂量依赖性降低细胞增殖活度，说明AngⅡ能促进培养的VSMC增殖，川芎嗪可以抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖，并且具有量-效关系。AngⅡ组VSMC的PKCζ与ERK1/2表达明显增加，中、高剂量川芎嗪组PKCζ与ERK1/2的表达显著降低。有文献报道［7］, AngⅡ通过与VSMC表面的AngⅡ受体(AT1)结合,激活PKCζ,再由PKCζ激活ERK1/2并转位入核,从而实现细胞内的信号转导和细胞核内基因转录的活化,最终诱发VSMC增殖，说明PKCζ-ERK1/2通路在AngII诱导的VSMC增殖中发挥了重要作用。结合本实验提示：川芎嗪可通过抑制PKCζ-ERK1/2通路实现防止VSMC增殖的作用。川芎嗪通过何种机制抑制PKCζ与ERK1/2的表达尚不清楚，需进一步的研究和探讨。
        综上所述，川芎嗪能减弱AngII的促增殖作用，其抑制机制可能与阻断PKCζ-ERK1/2通路有关，这可能是川芎嗪抗血管再狭窄的一个重要机制。
       【参考文献】
         　　［1］Yang W, G J, Liu H,et al. Arsenic trioxide eluting stent reduces neointima formation in a rabbit iliac artery injury model［J］.Cardiovasc Res, 2006, 72(3):483.
       
       ［2］Chang SJ, Tzeng CR, Lee YH, et al.Extracellular ATP activates the PLC/PKC/ERK signaling pathway through the P2Y2 purinergic receptor leading to the induction of early growth response 1 expression and the inhibition of viability in human endometrial stromal cells［J］.Cell Signal, 2008 ,20(7):1248.
       
       ［3］Zhao Y, Liu J,Li L,et al.Role of Ras/PKCzeta/MEK/ERK1/2 signaling pathway in angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell proliferation［J］.Regul Pept，2005, 128(1):43.
       
       ［4］冯津萍, 卢奕, 陈星，等. 川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的探讨［J］. 中草药, 2007, 38（1）: 92
       
       ［5］梁爱群.川芎嗪的药理及机理研究［J］.时珍国医国药，2005，16（6），532.
       
       ［6］Racz GZ, Szucs A,Szlavik V,et al.Possible role of duration of PKC-induced ERK activation in the effects of agonists and phorbol esters on DNA synthesis in Panc-1 cells［J］.J Cell Biochem, 2006,98(6):1667.
       
       ［7］Godeny MD, Sayeski PP. ANG II-induced cell proliferation is dually mediated by c-Src/Yes/Fyn-regulated ERK1/2 activation in the cytoplasm and PKCzeta-controlled ERK1/2 activity within the nucleus［J］.AM J Physiol Cell Physiol. 2006,291(6): 1297.