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       【摘要】 
       目的从鲜蒜中分离纯化蒜酶，并研究其酶学性质、动力学特性以及临床常用溶剂对酶活力的影响，为今后进一步优化蒜酶的提取纯化工艺和临床应用提供必要理论参数。方法采用盐析、超滤、冷冻干燥等方法提取纯化蒜酶，SDS－Page凝胶电泳法测定纯化蒜酶分子量，丙酮酸法和考马斯亮蓝G-250法测定蒜酶活力。结果分离纯化所得蒜酶的分子量为97.88 KDa，纯度大于60％；蒜酶催化裂解天然蒜氨酸的最适温度为35℃，最适pH为7.00；随着温度的升高，蒜酶的稳定性下降；蒜酶在pH 6.5的缓冲体系中最稳定；以天然蒜氨酸为底物测得米氏常数Km=2.139 mmol·L-1，最大反应速度Vmax=41.67 U·mg-1（蛋白）；临床常用溶剂0.9％氯化钠注射液、复方氯化钠注射液（含0.85％NaCl、0.03％KCl、0.033％CaCl2）对蒜酶具有显著的激活作用，而5％葡萄糖注射液、10％葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液（含5％葡萄糖、0.9％氯化钠）则较强的抑制了蒜酶活力，75％和95％乙醇具有强烈的杀酶作用。结论蒜酶具有热不稳定性和pH不稳定性；其酶解反应选择在35℃和pH 7.00的缓冲体系中最佳；而蒜酶溶解在pH6.5的缓冲体系中能较长时间保持稳定；临床常用溶剂中，含氯化钠的注射液（不含葡萄糖）对蒜酶活力有显著的激活作用，而含有葡萄糖的注射液强烈抑制蒜酶活力；75％和95％乙醇作为消毒液使用时也应避免其对蒜酶的杀伤作用。实验结果对进一步优化蒜酶的提取纯化工艺研究以及蒜酶的临床应用具有指导意义。
       【关键词】  大蒜; 蒜酶; 酶学性质; 动力学特性; 临床常用溶剂
       Enzymatic Properties and Kinetic Charactristics of Homogeneous Alliinase from Garlic
       CAO Hong, YUAN Yaozuo, CHEN Jian
       1.Staff Room of Pharmacological Analysis，Department of Pharmacology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054,China; 2.Department of Chemistry, Chemistry and Chemical Engineering College, Shihezi University, Shihezi 832003, China; 3.Jiangsu Institute for Drug Control, Nanjing 210008, China
       Abstract：ObjectiveTo isolate alliinase （EC 4.4.1.4） from its natural source，garlic and to study the effect, enzymatic properties，kinetic charactristics as well as dissolvant commonly used in clinic on enzyme activity.MethodsThe purification of the enzyme consisted of salting-out step，ultrafiltration and freeze drying, etc. The relative molecular masses of this garlic enzyme was estimated by SDS－PAGE. Protein concentrations of allinase preparations were determined according to the method of Bradford with BSA as standard. Enzyme activity was assayed from the amount of enzymatically formed pyruvate using natural L-(+)-alliin as substrate. ResultsSDS－PAGE gave evidence that alliinase obtained from garlic consisted of two identical subunits with molecular weights of 97.88 KDa and 60％of purity. The highest enzyme activity for the purified alliinase was found to be at 35℃. The enzyme pH optimal had at pH7.0，but it was the most stable at pH6.5. The Km value for alliinase from garlic was estimated to be 2.139mmol·L-1 for natural L-(+)-alliin. Vmax using natural L-(+)-alliin as substrate was at 41.67 U·mg-1 protein）. When Sodium Chloride Injections containing 0.9%NaCl or complex prescription(0.85%NaCl, 0.03%KCl, 0.033%CaCl2) was used as solvent, there was a stimulation of enzyme activity, but Glucos Injections respectively containing 5％glucos，10％glucos，5%glucose and 0.9%NaCl gave a strong inhibition. The lyase solved in 75% or 95% alcohol completely lost its activity rapidly.ConclusionIt has been demonstrated that alliinase is sensitive to pH or temperatures. Injections containing glucos used as solvent is not suitable for this enzyme. Using 75% or 95% alcohol as disinfectant should avoid lowering the enzyme activity. The present paper gave directions to optimizing purification procedure of enzyme and its clinical application.
       Key words：Garlic;  Alliinase;  Enzymology properties;  Kinetic charactristics;  Clinical dissolvant commonly used
       
       大蒜Allium sativum L.为百合科葱属多年生草本植物，作为药食两用，在世界上的许多国家均有悠久历史。现代研究表明，大蒜主要具有抗感染、防治心血管疾病和抗肿瘤等三大功效。目前公认大蒜的功效成分是蒜酶（Alliinase，EC 4.4.1.4）催化裂解S－烯丙基－L－半胱氨酸亚砜（S-allyl-L-cysteine sulfoxide），即蒜氨酸（Alliin），而产生的大蒜辣素（Allicin）、阿霍烯（Ajoene）等系列含硫有机化合物（见图1）。蒜酶存在于大蒜细胞的液泡中，而蒜氨酸存在于细胞质中，当大蒜完整细胞受损时，二者相遇发生上述酶解反应［1］。
       
       由于大蒜功效成分的分离、提取或人工合成十分困难，而且化学性质极不稳定，易分解，无法长期保存，现有技术不可能直接制成药物制剂应用于临床，因此目前国内外的研究思路是从鲜蒜中分别提取化学性质相对稳定的蒜氨酸及蒜酶，然后科学组方，制成蒜氨酸/蒜酶复合制剂，让其在体内释放大蒜辣素、阿霍烯等有效成分，充分发挥疗效。
       
       一直以来，有关蒜酶酶学性质和动力学特性的研究报道很多，报道的结果却不尽相同。本文从鲜蒜中分离纯化蒜酶后，研究了蒜酶的酶学性质、动力学特性以及临床常用溶剂对酶活性的影响，为今后进一步优化蒜酶的提取纯化工艺和临床应用提供必要、可靠的理论参数。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器
       电泳记录及分析系统（Kodak DS120）；数据处理软件（Kodak DS 1D, Version 2.0.3.）；双光束紫外－可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。
       1.2 原料鲜蒜（甘肃民乐）。
       1.3 药品与试剂
       5′－磷酸吡多醛（高纯级，上海三杰生物技术有限公司）；标准分子量蛋白（上海西巴斯生物技术开发有限公司）；丙酮酸钠（生化试剂，上海蓝季科技发展有限公司）；蒜氨酸底物（从鲜蒜中提取天然底物，课题组自制）；牛血清白蛋白（标准品，上海蓝季科技发展有限公司）。
       2 方法
       2.1 蒜酶的分离纯化
       大蒜脱皮、精选、清洗、冷藏（0～4℃）12 h。加入Na/K磷酸缓冲液（pH 6.5）打浆、浸提、过滤。取粗酶液，45％饱和度的硫酸铵盐析，离心。取蛋白沉淀重溶，超滤脱盐，冷冻干燥，即得。
       2.2 蒜酶纯度及分子量测定
       蒜酶供试品配制成2 mg·ml-1溶液，采用14.7％分离胶，5％浓缩胶，恒电压60 V，考马斯亮蓝R-250染色法染色。结果使用Kodak DS 1D（Version 2.0.3.）数据处理软件处理。
       2.3 酶浓度测定
       采用测丙酮酸法。即1.00 ml蒜酶溶液与1.00 ml蒜氨酸底物溶液(蒜氨酸过量)，在35℃下准确反应5 min后，立即加入10%三氯乙酸2.00 ml，终止反应。然后，加入1.00 ml 2,4-二硝基苯肼试液，室温下反应5 min后，再加入2.5 mol·L-1NaOH溶液 5.00 ml，室温下反应10 min显色后，于520 nm处测定吸光度。(以钝化酶、底物、2,4-二硝基苯肼、NaOH反应体系为空白)。
       
       35℃下，每分钟内生成1 μmol丙酮酸定义为1个酶活力单位（unit，U）。
        蛋白质浓度测定：采用Bradford法（考马斯亮蓝G-250染色法）［1］。
       3  结果
       3.1  蒜酶纯度及分子量测定
       本实验选择用上样量为5 μg的窄谱带进行分子量计算，减小迁移距离的测定误差；用上样量为20 μg的谱带进行计算蒜酶的纯度，提高杂质的检出率（见图2）。
       
       结果表明，以迁移率（Y）对标准蛋白分子量对数（X）进行线性回归，得方程Y=-0.925 1X+4.819， r=0.990 1，计算蒜酶的单个亚基分子量约为48.94 KDa，则蒜酶全酶的分子量为97.88 KDa。
        对扫描图“4”带的各谱带进行积分（见图3），按峰面积归一化方法计算，主峰面积约为总峰面积的60%，即该蒜酶样品的纯度在60%以上。
       3.2 酶反应的最适温度
       用Na2HPO4－KH2PO4缓冲溶液（pH 6.5）分别配制蒜酶溶液（0.05 mg·m l-1）和蒜氨酸底物溶液（2 mg·ml-1）。然后在预先设定的20，30，35，40，45，55℃的水浴温度测定酶活力。此处酶活力单位定义为不同温度下，每分钟内生成1 μmol丙酮酸定义为1个酶活力单位（unit，U）。比活力以每克冻干酶粉所具有的酶活力单位数表示，即酶活力U/g（酶粉）。
         
       结果显示，蒜酶催化裂解蒜氨酸的最适温度为35℃（见图4）。
       3.3 酶反应的最适pH
       用1/15 mol·L-1Na2HPO4和1/15mol·L-1KH2PO4溶液分别配制pH5.00，5.50，6.00，6.50，7.00，7.50，8.00的缓冲体系。然后用不同pH缓冲体系配制底物溶液（2 mg·ml-1）和酶溶液（0.05 mg·ml-1）。35℃下，测定不同pH条件下的酶活力。此处酶活力单位定义为35℃下，每分钟内生成1 μmol丙酮酸定义为1个酶活力单位（unit， U）。比活力以每克冻干酶粉所具有的酶活力单位数表示，即酶活力U/g（酶粉）。
       
       结果显示，蒜酶催化裂解蒜氨酸的最适pH为7.00（见图5）。
       3.4  温度的稳定性
       用Na2HPO4－KH2PO4缓冲溶液（pH 6.5）分别配制蒜酶溶液（0.05 mg·ml-1）和蒜氨酸底物溶液（2 mg·ml-1）。然后将蒜酶溶液在预先设定的5，20，30，35，40℃的水浴温度中放置2 h后，35℃下，测定酶活力。在最适pH和最适温度下测定起始酶活力，以起始酶活力为100%，计算相对比活力。
       
       测得蒜酶活力的变化情况如图6所示，蒜酶活力5℃下降9.2％，20℃下降17.24％，30℃下降36.63％，35℃下降65.38％，40℃下降84.92％。从中可以看出，随着温度的升高，蒜酶的稳定性下降，并且随着温度的升高，酶活下降的幅度增大。显然，蒜酶溶解后，酶液不宜长时间放置于较高温度（＞20℃）下，温度越低（≤20℃），蒜酶越稳定。
       3.5 pH的稳定性 
       用Na2HPO4－KH2PO4缓冲溶液（pH 6.5）分别配制蒜酶溶液（0.05 mg·ml-1）和蒜氨酸底物溶液（2 mg·ml-1）。然后将蒜酶溶液在预先设定的5，20，30，35，40℃的水浴温度中放置2 h后，35℃下，测定酶活力。在最适pH和最适温度下测定起始酶活力，以起始酶活力为100%，计算相对比活力。
       
       测得蒜酶活力的变化情况如图7所示，蒜酶在pH 6.5的缓冲体系中最稳定。而当pH>6.5或pH<6.5时，蒜酶活力明显降低，并随着pH的增大或减小，酶活的降低程度显著增大。
       3.6 酶动力学特性
       用Na2HPO4－KH2PO4缓冲溶液（pH 6.5）分别配制0.05 mg·ml-1蒜酶溶液和0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5，2.0 mg·ml-1天然蒜氨酸底物溶液。在最适pH和最适温度下，测定不同底物浓度下的蒜酶活力。此处酶活力单位定义为35℃下，每分钟内生成1 μmol丙酮酸定义为1个酶活力单位（unit，U）。比活力以每mg蛋白质所具有的酶活力单位数表示，即酶活力U·mg-1（蛋白）。
       
       采用Linewearern－Burk作图法作图，计算得最大反应速度Vmax和米氏常数Km。
        根据实验测得结果，采用Linewearern－Burk作图法作图（图8～9）。计算得最大反应速度Vmax=41.67 U·mg-1（蛋白），米氏常数Km=2.139 mmol·L-1。
       3.7 临床常用溶剂对蒜酶活力的影响
       分别用0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液、10％葡萄糖注射液、复方氯化钠注射液（含0.85％NaCl、0.03％KCl、0.033％CaCl2）、葡萄糖氯化钠注射液（含5％葡萄糖、0.9％氯化钠）、75％乙醇、95％乙醇作溶媒，配制蒜酶溶液（0.05 mg·ml-1）。天然蒜氨酸底物溶液用水配制成2.0 mg·ml-1。然后，35℃下，测定酶活力。在最适pH和最适温度下测定起始酶活力，以起始酶活力为100%，计算相对比活。35℃下，每分钟内生成1 μmol丙酮酸定义为1个酶活力单位（unit，U）。
       
       实验结果（见图10）表明，以0.9％氯化钠注射液、复方氯化钠注射液作溶媒时，蒜酶活力均显著提高（0.9％氯化钠注射液147.99%，复方氯化钠注射液149.22%），而含葡萄糖的其它溶媒则都较强的抑制了蒜酶活力，消毒液75%乙醇和95％乙醇具有强烈的杀酶作用。因此，在蒜酶的临床应用中，对于配伍溶剂和消毒液，应当有所选择和慎重使用。
       4 讨论
        蒜酶是二聚体糖蛋白酶［2］，单个亚基的分子量为48.94 KDa，则全酶的分子量为97.88 KDa。蒜酶具有热不稳定性和pH不稳定性；其酶解反应选择在35℃和pH 7.00的缓冲体系中最佳；蒜酶溶解后，若放置较长时间，应选择在低温（≤5℃）和pH 6.5的缓冲体系中为宜。以天然蒜氨酸为底物，测得蒜酶对该底物的米氏常数Km=2.139 mmol·L-1，最大反应速度Vmax=41.67 U·mg-1（蛋白）。临床常用溶剂中，含氯化钠的注射液（不含葡萄糖）对蒜酶活力有显著的激活作用，而含有葡萄糖的注射液则强烈抑制蒜酶活力。显然，临床应用时，含有葡萄糖的注射液不宜作为蒜酶的配伍溶液。75％和95％乙醇作为消毒液使用时也应避免其对蒜酶的杀伤作用。本文对进一步优化蒜酶的提取纯化工艺以及蒜酶的临床应用具有指导意义。
       【参考文献】
         　　［1］药立波, 常智杰. 医学分子生物学实验技术［M］. 北京：人民卫生出版社，2003.
       
       ［2］Kuettner BE, Hilgenfeld R, Weiss SM. Purification, characterization, and crystallizaion of alliinase from garlic［J］. Arch. Biochem Biophy, 2002, 402: 192.