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       【摘要】 
       目的探讨扶正利湿活血中药复方水提物和醇提物对先天感染乙肝病毒（HBV）的鸭胚肝细胞乙型肝炎病毒（DHBV）的抑制作用。方法荧光定量PCR技术对鸭胚尿囊液DHBV DNA分析筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚，对DHBV阳性的鸭胚肝细胞原代培养；细胞接种后第3天分组加入不同剂量扶正利湿活血复方水提物和醇提物，共6 d，分别于药物干预前、药物干预第3天、第6天、停药第2天收集培养上清；辛酸钠法提取上清DHBV DNA，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测分析血清DHBV DNA的含量。结果水提物各剂量组组内不同时间点DHBV DNA载量相比无显著性差异（P﹥0.05），仅水提物低剂量组DHBV DNA载量显著低于相同时间点病毒对照组（P<0.05）；醇提物中、低剂量组在给药后和停药后培养上清DHBV均明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），扶正利湿活血复方醇提物高剂量组在给药后第3天时DHBV明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），第6天时组内比较无明显下降（P>0.05），而在停药后第3天时组内与组间比较又均有显著性差异（均为P<0.01）。结论扶正利湿活血复方醇提物对鸭胚肝细胞中的DHBV有直接抑制作用，水提物在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。
       【关键词】  扶正利湿活血；鸭乙型肝炎病毒；肝细胞； 荧光定量PCR
       Inhibitory Effect of Chinese Medicine Compound Fuzheng Lishi Huoxue on Duck Hepatitis B Virus (DHBV) in Duck Embryo Liver Cells
       LIU Hanping, HE Jinyang, LIANG Bo
       1.Photonic Chinese Medicine Lab., South China Normal University, Guangzhou 510631, China； 2. Tropical Medicine Institute of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405 , China; 3.South China Normal University Hospital, Guangzhou 510631, China
       Abstract:ObjectiveTo study the inhibitory effect of Chinese medicine compound prescriptions Fuzheng Lishi Huoxue on duck hepatitis B virus (DHBV) in duck embryo liver Cells. MethodsThe duck embryo liver cells with congenital infection DHBV were incubated with different concentration extracts of Chinese medicine compound Fuzheng Lishi Huoxue, which was extracted with water and alcohol respectively. The level of DHBV DNA in culture supernatants was detected using FQ-PCR at different time points after the cell being inoculated. ResultsWater extract of Fuzheng Lishi Huoxue had no significant effect on supernantant DHBV DNA Content  (P﹥0.05), but alcohol extract of Fuzheng Lishi Huoxue supernatant DHBV DNA content (P<0.01).ConclusionThe alcohol extract of Chinese medicine Compound Fuzheng Lishi Huoxue has direct inhibitory effect on duck hepatitis B virus (DHBV) in duck embryo liver cells.
       Key words:Compound Fuzheng Lishi Huoxue;  Duck Hepatitis B virus (DHBV);  Liver Cell;  FQ-PCR
       
       乙型病毒性肝炎是当今世界上3大顽症之一,全世界范围内大约有4亿乙型肝炎病毒(HBV) 感染者［1］，我国一般人群中HBsAg流行率为9.09% ,估计约1.1亿人为慢性HBV 感染,占全世界慢性HBV感染者的1/3［2］。乙型肝炎抗病毒治疗的目标是持续抑制HBV复制、清除病毒,阻止肝脏炎症和坏死的进展,使疾病获得痊愈［3］。由于HBV 复制的原始模板cccDNA 难以消除,加之患者存在不同程度对HBV 的免疫耐受, 使得目前的治疗药物要达到彻底清除病毒是非常困难的，如核苷类似物抗HBV 作用强而快,但疗程难以确定,长期治疗均可产生耐药突变,在治疗过程中会引起ALT和HBV DNA的突破,可使病情恶化［4］。
        中医药具有抑制HBV复制、抗肝纤维化、改善肝功能、保护肝细胞等作用,在治疗乙型病毒性肝炎方面有独特的优势。中药复方是中医防治疾病的特殊手段，最能体现中医理论的精髓，是治疗乙型病毒性肝炎的有效手段。本研究基于乙型病毒性肝炎多为湿热疫毒侵袭、肝脾肾虚损、瘀血阻络，终致气血、阴阳紊乱，脏腑功能出现虚损性和失调性变化的病机特点，以扶正利湿活血为法，研究中药复方水提物和醇提物对先天感染的鸭胚肝细胞DHBV的抑制作用，以期初步探索中药扶正利湿活血复方治疗鸭慢性乙型肝炎的作用机制和靶点。
       1  材料和方法
       1.1  试剂和中药复方提取物制备
       孵化22～25日龄的鸭胚，自市场上购买。Trizol，购自Invitrogen公司；LA TaqDNA 聚合酶、dNTP (A、T、C、G 4 种碱基, 25 mmol/ L)，分子量Marker均购自Ferments 公司；青霉素、链霉素为上海先锋药业公司产品；Williams E培养基、胶原蛋白酶购自Sigma公司；PCR master Mix购自TOYOBO公司；PCR试剂胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。ABI7300型荧光定量PCR仪，水平电泳设备。
       
       扶正利湿活血中药复方主要含旱连草、女贞子、山药、炙甘草、益母草、白花蛇舌草、丹参等，各成分购自广州采芝林医药连锁店，水提物制备用水煎煮2次，合并提取液后加热浓缩至1 g/ml，储存于－20℃备用。醇提物用无乙醇浸泡，按处方比例称取药材250 g，加入无水乙醇800 ml，密封常温浸泡24 h后收集浸泡液；然后再如此法浸泡一次，合并浸泡液，减压浓缩至1 g/ml，储存于－20℃备用。
       1.2 先天感染DHBV阳性筛选
       将留取的尿囊液提取DNA，提取液组成：0.2 mol/L NaOH，1%（W/V）SDS；取20 μl尿囊液，加入60 μl提取液，混匀后室温放置10 min；再加入80 μl异丙醇，混匀后4℃，13 000 r/min离心7 min，弃上清，再加入40％异丙醇10 000 r/min，5 min洗1次，然后用20 μl去离子水溶解沉淀。用PCR法检测DHBV，PCR引物为：gatccactcctgggaaacaa-DS1；cagacagcgtggctaattga-DS2。扩增产物为589 bp；条件为：94℃预变性4 min，然后94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，1 min。进行40个循环，然后再72℃延伸5 min。
       1.3 鸭胚肝细胞培养
       打开鸭胚后收集尿囊液留作筛选DHBV先天阳性鸭胚，筛选方法如前述。然后切取整个肝脏，用Hank"s洗涤并剪碎，然后置于含有0.2％胶原酶II的培养基中于4℃消化过夜。培养基采用William E培养基，并添加辅助成分，其辅助成分及浓度分别为：L-谷氨酰氨2 mM，HEPES15 mM，胰岛素1 μg/ml，青霉素100 U/ml，链霉素33 μg/ml，氢化可的松10－5M，二甲基亚砜1.5％，调pH至7.2。消化完后，每只鸭胚肝脏细胞用5 ml培养基洗涤两次，加入24 ml培养基，吹打混匀后，加入24孔板中，每孔1 ml。贴壁3 h后换液，以后每天换液1次。
       1.4 药物作用
       在细胞接种后第3天开始上药，扶正利湿活血复方水提物和醇提物，均为3个浓度，分别为10，1，0.1 mg/ml。以拉米夫定作为阳性对照药，其浓度为1 mmol/ml。上药6 d，分别在药物干预前（D0）、第3天（D3）、第6天（D6）、停药第2天（P2）收集培养上清液，保存于－70℃待检。
       1.5 DHBV荧光定量检测方法
       DHBV DNA提取用辛酸钠法，40 μl培养上清液中加入120 mmol/L辛酸钠20 μl，99℃加热10 min，14 000 r/min离心10 min，取2 μl上清进行检测。FQ-PCR检测方法：以插入了DHBVS基因片段nt1251-1773的质粒作为标准品，10倍稀释做标准曲线。在标准品序列中设计TaqMan引物探针，序列为，sense primer：CAGGCTTGCTGTATCTGACGG；antisense primer： GGCAGTAGTGAAGAGATGGAGGA  ； Probe： FAM- CTGAGACCGACGCCCATTGGAGCTTT－TAMRA。用TOYOBO公司的realtime PCR masterMix为PCR试剂，采用25 μl反应体系。反应条件为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s；60℃退货延伸1 min，进行40个循环。
       1.6 统计学方法
       PCR反应完毕用软件分析计算后，对样品的每个结果乘以1.5，即得出样品的实际DHBV拷贝数。计量资料以±s表示,治疗前后比较采用配对资料t检验,组间比较采用方差分析, 检验水准均为α＝0.05，采用SPSS1010统计软件分析数据。
       2  结果
       2.1  扶正利湿活血复方水提物对鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的影响
       扶正利湿活血复方水提物各剂量组组内不同时间点DHBV DNA载量相比无显著性差异（P＞0.05），仅水提物低剂量组DHBV DNA载量显著低于相同时间点病毒对照组（P<0.05）；拉米夫定组在给药后第3、6天及停药后第3天与开始给药时（D0）有显著降低（均为P<0.01）。因此扶正利湿活血复方水提物组对先天感染鸭胚肝细胞培养上清液中的DHBV无明显抑制作用。见表1。表1  扶正利湿活血复方水提物对鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的影响（略）
       2.2 扶正利湿活血复方醇提物对鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的影响
       表2显示，拉米夫定在给药及停药后培养上清中的DHBV载量都明显降低（组间、组内比较均为P<0.01）；扶正利湿活血复方醇提物高剂量组在给药后第3天（D3）时DHBV明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），而到给药后第6天时组内比较无明显下降（P>0.05），而在停药后第3天（P2）时组内与组间比较又均有显著性差异（均为P<0.01），所以扶正利湿活血复方醇提物高剂量组可能对培养上清中的DHBV有抑制作用，但还需要更多重复。而扶正利湿活血复方醇提物中、低剂量组在给药后和停药后培养上清DHBV均明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），这说明扶正利湿活血复方中、低剂量组均可显著抑制培养上清液中的DHBV。表2  扶正利湿活血复方醇提物对鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的影响（略）
       3 讨论
       
       目前，应用于HBV相关研究的体外细胞培养系统包括能够直接感染乙肝类病毒的HepaRG细胞系［5］、DHBV感染原代鸭肝细胞及不能直接感染的肝癌细胞系。肝癌细胞系不能直接感染病毒［6］，只能通过基因转染而复制子代病毒，该类细胞中没有HBV自然感染中必有的复制模板：cccDNA。而DHBV在鸭肝细胞中复制具有所有的复制中间体，因此鸭胚肝细胞在HBV感染机理研究、抗HBV药效等研究中得到广泛应用。
       
       乙型肝炎抗病毒治疗的目标是持续抑制HBV复制,以减轻和防止肝脏病变加重和复发,减缓和防止进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。然而从治疗策略上看,最终的治疗目标应该是清除病毒,阻止肝脏炎症和坏死的进展,使疾病获得痊愈［3］。在临床中最常用的抗HBV西药有两类，即核苷类似物和干扰素类。干扰素也具有一定的抗HBV作用，但临床中真正适宜于干扰素治疗的患者并不多，且已有研究表明，在应用干扰素治疗过程中，患者血清中往往出现干扰素抗体［7］，其近期疗效中血清HBeAg 和HBV DNA 阴转率仅为40 %左右［8］，所以干扰素也不能清除HBV，停药后也可出现HBV反跳，,且由于一定的不良反应及价格昂贵而使临床应用受限。所以，这二类药物并不是理想的抗HBV药物，且这二者价格昂贵，所以到目前为止，人们仍然在努力寻找更适宜的抗HBV药物。
        拉米夫定(lamivudine,LMD 或3TC)为双脱氧核苷类似物,是逆转录酶抑制剂。拉米夫定最初用于治疗HIV感染,以后发现对于HBV复制具有抑制作用［9］。拉米夫定抗HBV作用表现在:①抑制血清HBV DNA；②使血清ALT恢复并保持正常；③阻止肝脏纤维化的进展；④促进HBeAg的血清转换,即HBeAg转阴,抗-HBe转阳。  但拉米夫定治疗乙型肝炎有两大缺陷，一是随着拉米夫定治疗时间的延长,检测到HBV酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)变异株(在嗜肝DNA病毒属的DNA聚合酶中存在YMDD)保守区域，这一区域的变异通常导致抗拉米夫定病毒株的形成［10］；二是肝炎治疗停药后出现ALT反跳,病情恶化。 
       中药复方是中医防治疾病的特殊手段，最能体现中医理论的精髓，在治疗慢性肝炎及抗HBV病毒方面有着潜在优势。乙型病毒性肝炎病机虽错综复杂，但湿热疫毒侵袭、肝脾肾虚损、瘀血阻络，终致气血、阴阳紊乱，脏腑功能出现虚损性和失调性变化是其主要病机特点。因此，本研究以扶正利湿活血为法，研究中药复方水提物和醇提物对先天感染的鸭胚肝细胞DHBV的抑制作用。从结果来看，扶正利湿活血复方水提物各剂量组组内不同时间点DHBV DNA载量相比无显著性差异（P＞0.05），仅水提物低剂量组DHBV DNA载量显著低于相同时间点病毒对照组（P<0.05）；拉米夫定组在给药后第3、6天及停药后第3天与开始给药时（D0）有显著降低（均为P<0.01），表明扶正利湿活血复方水提物在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。
        扶正利湿活血复方醇提物中、低剂量组在给药后和停药后培养上清DHBV均明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），这说明扶正利湿活血复方中、低剂量组均可显著抑制培养上清中的DHBV。扶正利湿活血复方醇提物高剂量组在给药后第3天（D3）时DHBV明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），而到给药后第6天时组内比较无明显下降（P>0.05），而在停药后第3天（P2）时组内与组间比较又均有显著性差异（均为P<0.01），所以扶正利湿活血复方醇提物高剂量组可能对培养上清中的DHBV有抑制作用。醇提物中的成分不同于水提物，其中可能含有直接抑制DHBV作用的物质，但还需进一步研究。
       【参考文献】
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