文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨金橘黄酮的免疫功能。方法环磷酰胺诱导小鼠免疫功能低下，予金橘黄酮，观察小鼠碳粒廓清指数K、吞噬指数a、胸腺和脾脏指数、耳肿胀度、血清溶血值（HC50）等指标的变化。结果与模型对照组相比，金橘黄酮80 mg/kg·bw 剂量时，小鼠碳粒廓清指数K、吞噬指数a、胸腺和脾脏指数、耳肿胀度有显著提高（P< 0.05），血清溶血值（HC50）有极显著提高（P<0.01）；金橘黄酮160 mg/kg·bw 剂量对全部试验参数的影响具有极显著性（P<0.01）。结论金橘黄酮对于免疫低下型小鼠的免疫功能具有一定的恢复作用。
       【关键词】  金橘；黄酮；免疫功能
       Effect of Fortunella crassifolia Flavonoid on Immune Function of Mice
       LI Jilie, WANG Wei, LIU Zhongmin, LI Zhonghai
       College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology , Changsha, Hunan,410004, China
       Abstract：ObjectiveTo explore the effects of Fortunella crassifolia flavonoids on immune function of immunodepressed mice.MethodsThe immunosuppressed mice were induced by cyclophosphamide (CY) and Fortunella crassifolia flavonoid was taken orally. The immunodulatory effects were measured by clearance rate K of charcoal particles, phagocytic index a, thymus and spleen index, ear swelling degree, HC50 value and so on. ResultsCompared with model group, the clearance rate K of charcoal particles, phagocytic index a, thymus and spleen index and ear swelling degree of 80 mg/kg·bw Fortunella crassifolia flavonoid dose group were significantly improved(P<0.05), and a very significant effect (P<0.01) was made to the HC50 value at this dose. While the dose was increased to 160 mg/kg·bw, all of the experimental parameters showed extremely significant improvements (P<0.01) .ConclusionFortunella mrassifolia flavonoid can partly rejuvenate the immune reactivity of the immunosuppressed mice.
       Key words：Fortunella cargarita；  Flavonoids；  Immune function
        金橘，系芸香科（rutacea）金橘属（Rutaceae）常绿小乔木的果实，又称夏橘、寿星柑。分为金弹、圆实金橘等6个品种。金橘果实富含挥发油、黄酮等生物活性物质［1］，目前果实除鲜食外还用于果脯、饮料等产品的加工原料［2］，但总体上对于金橘的研究与开发仍集中在单纯的加工方面。近年来，我们从深度开发金橘资源角度出发，对其活性物质的提取及其药用保健功能进行了一些研究［3～6］，本文则在此基础上进一步深入探讨金橘黄酮对免疫低下小鼠免疫功能的影响，提高人们对金橘深度开发的认识。
       1 材料
       1.1  药物及试剂
       实验药物［4］：金橘采自江西遂川，品种为金弹Fortunella crassifolia Swingle。取新鲜金橘皮，真空冷冻干燥，将干燥后的金橘皮粉碎过40目筛，用石油醚脱脂回流2 h，脱脂后按金橘粉∶酒精（80%）=1∶20（W/W）物料比，用MDS-6压力自控密闭微波萃取系统60 ℃萃取30 min，过滤，滤液用大孔树脂吸附，洗脱液经真空浓缩即为金橘黄酮提取物，测定总黄酮含量为33.82%，使用时配制成所需浓度；环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX），上海华联制药有限公司；碳酸氢钠、二硝基氟苯（2,4-Dinitrofluorobenzene，DNFB）均为化学纯，大连伊利特有限公司；印度墨汁，北京笃信精细制剂厂。
       1.2 动物单一性别昆明种小鼠，7～8周龄，体重18～22 g，湖南中医药大学实验动物中心购买，医动字20-001号。
       2 方法
       2.1 动物分组、造模及喂养方法
       健康小鼠适应环境7 d，随机分为空白对照组，模型对照组（Cy）和实验组（金橘黄酮高剂量组、中剂量组和低剂量组），每组10只。模型对照组和实验组腹腔注射环磷酰胺(Cy，80 mg/kg·bw)，连续7 d，造成 Cy 所致小鼠免疫功能低下模型［7］，空白对照组注射相同体积的生理盐水。小鼠免疫功能低下模型建立后，实验组按不同剂量灌胃金橘黄酮溶液，对照组灌胃等体积的蒸馏水，灌胃量为0.1 ml/10 g·bw，连续灌胃28 d 后，进行免疫指标测定。
       2.2 小鼠碳廓清指数K和吞噬指数测定［7］
       在末次灌胃金橘黄酮溶液30 min后，经小鼠尾静脉注射印度墨汁0.05 ml/10 g·bw，然后在不同时间（1 min，5 min）内，从眼框取静脉血20 μl，溶于2 ml 0.1% Na2CO3 溶液中，在680 nm下比色，测定吸光度，最后将小鼠颈椎脱臼处死，分别称取肝脏、脾脏重。
       廓清指数K=lgA1-lgA2t2-t1
       
       式中:A1，A2——在时间为t1，t2时所取血样的吸光度
           
       t1-t2——取两血样的时间差
       吞噬指数a=3k×体重肝脏重+脾脏重
       2.3 小鼠胸腺和脾脏指数测定［7］
       小鼠连续灌胃28 d 后，颈椎脱臼处死，剥取胸腺和脾脏，用电子天平称重，以胸腺与脾脏的重量指数(mg/10 g·bw)表示。
       2.4 DNFB诱导小鼠迟发型超敏反应（DTH）的测定［8］
       小鼠连续灌胃28 d 后，腹部去毛，用 1% DNFB 均匀涂抺，末次给金橘黄酮溶液30 min后，将1% DNFB 均匀涂抺于小鼠右耳进行攻击，24 h 后，颈椎脱臼处死，用打孔器取直径8 mm的耳片，称重，计算肿胀率。
       肿胀率(%)=（右耳重–左耳重）/ 左耳重×100%
       2.5 小鼠血清溶血值（HC50）的测定［9］
       小鼠连续灌胃第24天后，每只小鼠腹腔注射 2% 鸡红细胞（SRBS）0.2 ml 进行免疫，免疫后继续灌胃4 d，然后眼球取血离心分离血清。用生理盐水稀释血清至500 倍，取1 ml 稀释后的血清置试管内，依次加入10%（V/V）SRBS 0.5 ml，补体1 ml（用生理盐水按1∶10稀释），与不加血清的生理盐水试管作对照，于37℃保温30 min，0℃终止反应。离心后取上清液于540 nm 测吸光度值（OD），另设不加血清的空白对照，计算样品的半数溶血值。
       溶血值HC50=（样品的吸光度值 / SRBC半数溶血时的吸光度值）
       × 稀释倍数
       2.6  数据处理方法
       实验数据以±s表示，正态分布的两组的均数比较用t检验，统计分析采用SPSS13.0软件处理，显著性界值P=0.05。
       3 结果
       3.1 对小鼠碳廓清的影响
       单核巨噬细胞是非特异性免疫的重要组成细胞之一，可迅速吞噬和清除进入机体的细菌、异物等抗原性物质，巨噬细胞廓清指数K的多少可以反映其吞噬功能a的强弱。另外，单核巨噬细胞所分泌的多种细胞因子对非特异性免疫和特异性免疫又具有调节作用，可通过抗原呈递功能间接的启动机体的特异性免疫应答［10］。因此，根据碳廓清指数K和吞噬指数a反映出的单核巨噬细胞吞噬能力的大小，可以反映机体的免疫能力的强弱。
        如表1所示，实验各组小鼠的廓清指数K和吞噬指数a均有提高，与模型对照组相比，金橘黄酮高剂量组的廓清指数K提高41.42%（P<0.01），吞噬指数a提高43.58%（P<0.01），金橘黄酮中剂量组廓清指数K提高26.92%（P<0.05），吞噬指数a提高27.61%（P<0.05），说明金橘黄酮高、中剂量能显著提高免疫低下型小鼠单核巨噬细胞吞噬功能，具有明显改善小鼠的非特异性免疫功能。表1  金橘黄酮对小鼠碳廓清的影响（略）
       3.2  对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
       胸腺和脾脏为体内主要的免疫器官，胸腺指数和脾脏指数大小的改变提示机体对免疫调节作用的强弱变化。实验结果如表2所示，各给药组小鼠胸腺指数和脾脏指数都有不同程度的提高。与模型对照组相比，金橘黄酮高剂量组的胸腺指数提高34.3%（P< 0.01），脾脏指数提高25.8%（P<0.01），金橘黄酮中剂量组胸腺指数提高27.3%（P<0.05），脾脏指数提高17.3%（P< 0.05），金橘黄酮高剂量给药组效果极为显著，提示金橘黄酮对免疫低下型小鼠免疫的调节有增强作用。表2  金橘黄酮对小鼠胸腺和脾脏指数的影响（略）
       3.3 对DNFB诱导小鼠迟发型超敏反应的影响
       DNFB是一种半抗原，与皮肤蛋白结合形成抗原，能刺激T淋巴细胞增值成致敏淋巴细胞，再次攻击后会诱发迟发型超敏反应。迟发性超敏反应是T细胞介导的兼有巨噬细胞参与的特异性炎症反应，与机体细胞一致，可根据肿胀率的大小，说明其细胞免疫力强弱。
        如表 3 所示，不同剂量的金橘黄酮在一定程度上都具有提高小鼠耳肿胀的作用，随着剂量的增加，耳肿胀率呈上升降趋势，与模型对照组相比，金橘黄酮高剂量组的耳肿胀率提高36.91%（P<0.01），金橘黄酮中剂量组耳肿胀度提高21.42%（P<0.05）。结果表明，金橘黄酮能明显地增强DNFB引起的小鼠的DTH，说明其可以激活T细胞和巨噬细胞的特异性免疫功能。表3  金橘黄酮对小鼠耳肿胀度的影响（略）
       3.4 对小鼠血清溶血素的影响
       溶血素（IgM）是反映体液免疫功能状况的一种方法。血清溶血素水平反映特异性体液免疫能力，如果溶血素生成增多，则表明机体的体液免疫作用增强。如表4所示，与模型对照组相比，各剂量实验组均能提高小鼠半数溶血值，中剂量组与高剂量组的小鼠溶血值HC50分别提高了73.34%和49.36%，均达到极显著效果（P<0.01），说明金橘黄酮可提高免疫低下型小鼠特异性体液免疫功能。表4  金橘黄酮对小鼠血清溶血素的影响（略）
       4  结论
        本实验对 Cy 所致免疫低下型的小鼠，经过金橘黄酮灌胃28 d 后，与模型对照组相比，小鼠碳廓清指数K和吞噬指数、血清的溶血素水平、胸腺和脾脏指数及对DNFB诱导的耳肿胀度都有显著提高。这表明，金橘黄酮具有提高 Cy 所致免疫低下型小鼠免疫功能的作用，可能是一种良好的免疫调节剂，有待进一步研究和开发。
       【参考文献】
         　　［1］Hyang-Sook Choi．Characteristic Odor Components of Kumquat (Fortunella japonica Swingle) Peel Oil［J］. Agric. Food Chem. 2005, 53:1642.
       
       ［2］方修贵，林媚，李嗣彪，等．金柑果实的综合开发利用［J］．渐江柑橘，2003，20（4）：29.
       
       ［3］黎继烈，张慧，王卫，等．金橘黄酮抑菌作用研究［J］．食品与机械,2008，24(5):89.
       
       ［4］黎继烈，王卫，曾超珍，等．金橘黄酮对肥胖型高血脂大鼠的降血脂功能研究［J］.中南林业科技大学学报（自然科学版），2008，28（5）:36．
       
       ［5］黎继烈，李忠海，钟海雁，等．金橘黄酮对小鼠血糖的影响［J］．中药药理与临床，2007，3：56.
       
       ［6］黎继烈，刘宗敏，钟海雁，等．金橘总黄酮对小鼠胃肠吸收功能的影响［J］．中南林业科技大学学报（自然科学版），2007，27（2）：50.
       
       ［7］朱正美．简明免疫学技术［M］．北京:科学出版社，2002:150．
       
       ［8］赵铁华，邓淑华，高 巍．黄芩茎叶总黄酮对免疫功能影响的实验研究［J］．中国中医药科技，2001，8(3)：177.
       
       ［9］Guota H O. Effect of supplementation of processed maize germ cake on nutritional quality of maize ［J］. Food Sci Technol，2001，38：507.
       
       ［10］张剑，李素君，籍保平，等．柳蒿芽对小鼠免疫功能的影响［J］．食品科学，2008,5：405.