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       【关键词】  悦肝胶囊；,,衰老；,,大鼠肝细胞
       摘要：目的探讨悦肝胶囊的抗衰老作用。方法以D半乳糖诱导大鼠肝细胞衰老模型，观察悦肝胶囊对肝细胞的形态结构、组织化学以及对SOD、MDA活性的影响。结果悦肝胶囊可明显降低MDA含量，提高SOD活性；组织化学及超微结构观察表明，模型组SDH活性下降，ACP活性增高，线粒体明显肿胀、变性、嵴断裂。悦肝胶囊可减轻上述肝损伤程度。结论 悦肝胶囊对D半乳糖损伤原代培养大鼠肝细胞具有保护作用。
       关键词：悦肝胶囊；  衰老；  大鼠肝细胞
       The Antiaging Effects of Yuegan Capsule on Mice Cultured Hepatocytes in vitro
       PIAO Lihua, JIN Zheng, LI Xiangwu， CAI Yinglan
       (College of Medicine, Yanbian University Jilin Yanji, 133000, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the antiaging effects of Yuegan capsule. Methods Hepatocytes injury models were induced by Dgalactose in rats in vitro, and treated with Yuegan capsule. Structure, cytochemistry of rat hepatocytes and effect of SOD, MDA activities were observed. Results Yuegan Capsule decreased the content of MDA and increased SOD activity. According to the observation of histochemistry and ultrastructure, it showed that SDH activity decreased, ACP activity increased, the mitochondrion swelled and became deformed, crest broke. Yuegan capsule alleviated denatured degree above. Conclusion The Yuegan Capsule has protective effects on Dgalactoseinduced injury of primary cultured rat hepatocytes.
       Key words：Yuegan Capsule；  Aging；  Rat hepatocytes
   
　　悦肝胶囊主要由葛根、丹参、西洋参、麦冬等4味中药水提物按适当比例配制而成的复方中成药。此药对体外培养肝细胞四氯化碳损伤具有良好的保护作用。为探讨悦肝胶囊是否具有抗衰老作用，本实验观察了悦肝胶囊对D半乳糖所致衰老大鼠肝细胞氧自由基相关指标的影响，以及肝细胞超微结构、组织化学的改变，为寻找有效的抗衰老药物提供理论和实验依据。
       1  材料与方法
       1.1  动物 Wistar系大鼠乳鼠，鼠龄1~5 d，由延边大学医学院实验动物科提供。
       1.2  药物与试剂悦肝胶囊由延边大学长白山天然药物研究中心提供。制备方法：葛根30 g，丹参30 g，麦冬20 g，西洋参20 g，加蒸馏水煮1 h后过滤，滤出液备用，把原药再煮1 h后过滤，把第1次滤出液和第2次滤出液混合，浓缩成100 ml即得。D半乳糖为上海试剂二厂产品。（批号为980218）人参皂苷为吉林省白山市靖宇县黄封参药业公司产品，用RPMI1640培养液配成300 μg/ml浓度用于实验 ，新生小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，RPMI1640培养基为日本株式会社产品，胰蛋白酶为美国DIFCO公司产品，胶原酶为美国SIGMA化学公司产品。SOD、MDA试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，其他试剂均为国产分析纯。
       1.3  仪器 超净工作台为北京昌平长城净化设备厂产品，日本PC23232E型二氧化碳恒温培养箱，日本OLYMPUS倒置显微镜， 日本JEM1200EX型透射电镜,日本OLYMPUS万能显微镜,芬兰MK3酶标仪,德国ZK15超低温高速离心机,北京天地百年科技有限公司TD2000真彩色病理细胞显微分析系统。
       1.4  方法取日龄1~5 d的Wistar系大鼠乳鼠，无菌条件下取肝脏，磷酸缓冲液中去浆膜，切成小块，放入0.5 g/L胶原酶和0.6 g/L胰蛋白酶等量混合液内冷消化，经离心制成细胞悬液，接种于含有200 g/L小牛血清的RPMI1640培养基内，原代单层培养3~4 d，取生长良好的培养瓶40瓶分为4组。正常对照组每隔3 d更换培养基；模型对照组加入8 g/L D半乳糖 ；药物对照组加入8 g/L D半乳糖+300μg/ml人参皂苷；实验组加入8 g/L D半乳糖+500 μg/ml 悦肝胶囊。作用24 h后，模型对照组换接种培养基；药物对照组换加有300 μg/ml人参皂苷的培养基；实验组换加有 500 μg/ml悦肝胶囊的培养基继续培养。
       1.5  细胞化学观察取生长盖玻片，显示SDH、ACPase。SDH显示采用亚铁氰化甲法；ACPase显示采用Gomori法；染色后用日本OLYMPUS万能显微镜观察拍片并利用病理显微分析系统进行定量分析（每组随机选4张盖玻片，每张盖玻片再随机选3个视野，在400×下，测定每个视野颗粒面积百分比）。
       1.6  电镜标本观察 取生长良好的培养瓶，按电镜标本制作常规方法制作标本，JEM1200EX型透射电镜观察并拍片。
       1.7  生化测定SOD活性按黄嘌呤氧化酶法；MDA含量按硫代巴比妥酸法［1］。
       1.8  统计学方法  所有数据以 ±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行方差分析。
       　　2  结果
       2.1  超微结构 正常组肝细胞核圆，核仁明显，核膜清晰，粗面内质网常成群分布于核周及线粒体周围，呈平行排列。线粒体结构正常。模型组线粒体肿胀变性、嵴消失，溶酶体增多。悦肝胶囊组仍有少数线粒体肿胀、变性改变，但程度较模型组明显减轻。
       2.2  组织化学
       2.2.1  琥珀酸脱氢酶（SDH）染色结果SDH活性在光镜下显示为紫蓝色颗粒。正常组SDH活性强，颗粒多，染色深。模型组SDH活性减弱，紫蓝色颗粒减少，染色浅。药物对照组及药物组SDH活性均较模型组增强，颗粒多，染色深。
       2.2.2  酸性磷酸酶（ACP）染色结果ACP活性呈棕黑色沉淀。正常组ACP活性弱，酶颗粒染色较浅，均匀一致。模型组ACP活性增强，颗粒多，染色深。药物对照组与药物组ACP活性均减弱，颗粒染色较浅。结果见表1。
       表1  各组肝细胞细胞化学染色酶颗粒定量分析结果（略）
       与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，* P<0.01；n=12
       2.3  生化指标检测结果见表2。
       表2  各组肝细胞SOD、MDA的影响（略）
       与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；n=12
       　　3  讨论
       衰老“代谢失调学说”是目前被公认的一种衰老学说，据此有人研究出D半乳糖亚急性衰老模型。D半乳糖亚急性衰老模型的形成机理是在一定时间内给动物连续注射D半乳糖，使细胞内半乳糖浓度增高，其在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，这种物质不能进一步代谢而堆积在细胞内，从而影响细胞正常渗透压，使细胞肿胀，膜结构和生理功能紊乱，最终导致衰老的发生。此模型是当前抗衰老研究的较好模型，因此，本实验亦选用此方法制作了衰老大鼠肝细胞模型。线粒体是细胞的能量代谢中心。已有许多研究报道，衰老时线粒体发生肿胀、变性、数量减少等一系列退行性改变，因此，线粒体被认为在细胞衰老过程中具有重要的作用［2］。琥珀酸脱氢酶（SDH）是在柠檬酸循环中，催化琥珀酸与延胡索酸之间反应的一种酶。它存在于所有有氧呼吸细胞的线粒体内膜，是线粒体内膜的标志酶。SDH活性的变化与线粒体损伤同时出现，与线粒体的数目平行升降。因此，SDH可代表线粒体能量代谢，SDH的活性变化可作为线粒体损伤程度检测的敏感指标之一。本实验中观察到衰老模型组与正常组相比，肝细胞内SDH活性明显降低；而给药组与衰老模型组相比，肝细胞内SDH活性明显增强。这一结果表明衰老时较多线粒体的变性、坏死导致SDH活性降低，使细胞能量供应不足，从而影响肝的功能;悦肝胶囊可以减少线粒体的变性坏死，提高SDH活性，促进细胞能量代谢，增强细胞有氧呼吸，延缓肝细胞的衰老进程。酸性磷酸酶（ACP）主要存在于溶酶体内，是溶酶体的标志酶，研究表明肝细胞衰老、死亡时溶酶体膜脆性及通透性增强，致使溶酶体内ACP等水解酶渗入胞质，从而加速细胞的变性、坏死过程［3，4］。本实验中观察到衰老模型组与正常组相比，肝细胞内ACP活性明显升高；而给药组与衰老模型组相比，肝细胞内ACP活性明显降低。说明悦肝胶囊可能降低了溶酶体膜的脆性及通透性，阻止溶酶体内ACP等酸性水解酶的释放，使肝细胞内环境趋于稳定，减少了肝细胞的损伤。超氧化物歧化酶（SOD）作为体内重要的抗氧化酶，它能使超氧化物阴离子自由基变为过氧化氢和氧离子，从而减少脂质过氧化反应，使机体细胞和组织免受损伤。当机体氧化系统和抗氧化系统失衡时就会产生大量的自由基，最终形成过氧化脂质的分解产物之一是丙二醛（MDA）,因此通过测定MDA可以间接反映体内自由基产生和老化程度［5］。本实验结果表明：衰老模型组与正常组、悦肝胶囊组相比较SOD活性、MDA含量均有显著差异，P<0.05。说明D半乳糖所致的肝损伤中有大量自由基产生，悦肝胶囊能使衰老小鼠肝细胞SOD活性增强、MDA含量降低，这可能与悦肝胶囊的抗氧化作用有关。总之，本实验结果表明，悦肝胶囊对D半乳糖损伤原代培养大鼠肝细胞具有保护作用。，其机理可能是悦肝胶囊阻止脂质过氧化，以保护肝细胞的膜性结构不被破坏，阻止了内质网和线粒体的损伤，其确切的作用机理还需进一步研究。
       参考文献：
       ［1］  陈啸梅.组织化学［M］.北京：人民卫生出版社，1982：224 .
       ［2］  李质馨，朱辛为，徐  冶，等.胎脑提取液对衰老小鼠肝细胞酶活性影响的实验研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2003，12（2）:157.
       ［3］  魏太兴，邱保国，吕维善，等.现代老年学［M］.郑州：郑州大学出版社，2001：391.
       ［4］  皮明钧，文  彬，吴润秋，等.加味温胆汤对亚急性衰老大鼠大脑皮质超微结构改变的影响［J］.湖南中医学院学报，1999，19(1):8.
       ［5］  曹国华，陈吉隶，刘小鹏，等.缺锌及补锌对鼠脂质过氧化与超氧化物歧化酶的影响 ［J］.中华医学杂志，1991，71（1）：623.
       基金项目：吉林省延边州科技攻关项目（No.200206）
       (延边大学医学院， 吉林 延吉  133000)