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       【摘要】 
       目的观察六月青（Liuyueqing，LYQ）含药血清的体外抗乙型肝炎病毒的作用。方法以MTT法检测药物在体外对HepG2.2.15细胞的生长抑制作用，采用酶联免疫法（ELISA法）检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的滴度。结果LYQ含药血清对HepG2.2.15细胞50%生长抑制率的给药剂量为11.56 g·(kg·d)-1；而对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg 50%生长抑制率的给药剂量为0.178 g· (kg·d)-1，其治疗指数（TI）为64.94；另外，LYQ含药血清对HBeAg抑制作用不明显。结论LYQ含药血清在体外有显著的抗HBV的作用，且毒性较低。
       【关键词】  六月青含药血清； HepG2.2.15细胞； HBsAg； HBeAg
       The Inhibitory Effect of the Serum Containing Liuyueqing on the Expression of HBsAg and HBeAg in the HepG2.2.15 Cells
       LIN Xing, HUANG Quanfang, ZHANG Shijun, LIU Xi, HUANG Renbin1
       1.Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2.The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530021, China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of the serum containing Liuyueqing (LYQ) on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells. MethodsThe toxicity of the serum containing LYQ on HepG2.2.15 cells was detected by means of  MTT. The inhibitory effects of the serum containing LYQ on the excreation of HBsAg and HBeAg in HePG 2.2.15 cells were evaluated with method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe dose which the serum containing LYQ could inhibit 50% HepG2.2.15 cells was 11.56 g. (kg.d)-1. The dose which the serum containing LYQ could inhibit 50% HBsAg was 0.178g. (kg.d)-1, and its treatment index (TI) on HBsAg was 64.94.  The inhibitory effect of the serum containing LYQ on HBeAg was not obvious.  ConclusionThe serum containing LYQ can inhibit HBV significantly in vitro， and it is a low toxic drug.
       Key words：Serum containing Liuyueqing；  HepG2.2.15 cell；  HBsAg；  HBeAg
        六月青（Liuyueqing，LYQ）系爵床科（Acanthaceae）植物肖鸡笼（顶花马兰）Taraphochlamys affinis (Gr iff) Bremekhu (Strobilanthes affinis (Griff) Y.C.Tang)的干燥地上部分［1］。六月青是复方六月雪（CLYX）主要成分之一，本课题组前期研究表明，CLYX具有明显地抗HBV［2，3］和保护急性化学性肝损伤的作用［4］。本研究以转染有HBV DNA的HepG2.2.15为模型，采用中药血清药理学方法，观察LYQ含药血清对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响，并初步探讨其作用机制，为筛选出复方六月雪中抗HBV主要活性部位提供实验依据。
       1  材料
        HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）酶联免疫检测试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司）；HepG2.2.15细胞株，购自北京医科大学第一附属医院病毒研究所，本室自行传代，定期用G418（一种筛选抗生素）筛选；六月青水提物，由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。阿昔洛韦（Aciclovir　ACV）：湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号: 20070518；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司，批号13200-035）；小牛血清（美国Gibco公司，批号16000-036）；G418（美国Sigma公司，批号108321-42）。
       2 方法
       2.1  LYQ含药血清的制备
       3月龄Wistar大鼠70只，随机分为7组，每组10只。空白对照组：予等量的生理盐水；阳性对照组：ACV 1×10-4g·(kg·d)-1；LYQ1组：13.2 g·(kg·d)-1；LYQ2组：6.6 g· (kg·d)-1；LYQ3组：3.3 g·(kg·d)-1；LYQ4组：1.7 g·(kg·d)-1；LYQ5组：0.9 g·(kg·d)-1。各组动物在同样条件下饲养，每日早晚各1次空腹灌胃给药，连续给药7 d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃ 30 min灭活处理，经0.45 μm的微孔滤膜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。
       2.2 LYQ含药血清的细胞毒性实验（MTT法）
       取HepG 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104 cell·ml-1，加入96孔培养板中（每孔100 μl），置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培养24 h后，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，加入上述含药血清100 μl，每个浓度设6个复孔。连续培养72 h，培养结束前4 h，每孔加入MTT 10 μl，于CO2孵箱中继续培养。4 h后小心吸弃上清液后，每孔加DMSO 100 μl，微量振荡器振荡5 min，使结晶紫完全溶解。自动酶标仪（检测波长570 nm，参考波长630 nm）读取各孔OD值，记录结果。按Reed-Muench法计算半数细胞毒浓度（TC50）和最大无毒浓度（TC0）。
       2.3 ELISA法定量检测
       HBsAg和HBeAg将2×104 cell·ml-1的细胞悬液加24孔细胞培养板，每孔0.5 ml，置CO2孵箱（37℃ 5%CO2）中培养24 h后，细胞贴壁且生长良好，除去全部培养液，根据细胞毒性试验结果，以1.7 g·(kg·d)-1给药剂量组的含药血清为第1个浓度，再用完全培养液系列2倍稀释成4个浓度的应用液，即相当于5个给药剂量级别：1.7，0.85，0.425，0.213，0.107 g·(kg·d)-1的含药血清，每孔加入上述各级别的含药血清应用液0.5 ml，每个浓度设3个复孔。连续培养72 h后，分别吸出上清液置于1.5 ml灭菌Eppendorf管中，-20℃保存，统一待检。
       
       采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测，结果以抑制率表示，药物对抗原的抑制百分率（%）=［1-实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值］×100%，并按Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC50)。
       2.4 药效评价　
       一般用治疗指数（TI）来评价药物的临床应用前景。TI=TC50/IC50，TI>2为药物有效低毒，1       2.5 统计学处理　
       数据以±s表示，统计学采用SPSS 11.5软件，配对t检验。
       3 结果
       3.1 药物对细胞的毒性实验　
       各含药血清加于单层HepG 2.2.15细胞上，连续培养72 h后，观察细胞生长形态，检测有无病变。结果发现，除了给药剂量为13.2 g·(kg·d)-1组的含药血清对细胞生长抑制率大于50%外，其余各组的抑制率均小于50%；以MTT法测定细胞的活力，按照Reed-Muench法计算得出：TC0=1.65 g·(kg·d)-1，TC50=11.56 g·(kg·d)-1，即当LYQ给药剂量≤1.65 g·(kg·d)-1时，其含药血清对HepG2.2.15细胞没有毒性。结果见表1。表1  LYQ对HepG 2.2.15的生长抑制作用（略）
       3.2 病毒抗原抑制试验　
       HepG 2.2.15在24孔培养板上生长至单层，加入不同稀释倍数的LYQ含药血清，同时设空白对照组和细胞对照组，培养72h，分别取上清液测定HBsAg和HBeAg，并与细胞对照组比较，计算抑制率、IC50以及TI。
       
       实验结果表明，给药剂量相当于0.213～1.7 g·(kg·d)-1的LYQ含药血清对HBsAg的抑制率均高于50%，与细胞对照组比较均有P<0.05，其抑制作用呈现剂量依赖性，经计算，对HBsAg半数有效给药剂量IC50=0.178 g·(kg·d)-1，治疗指数TI＝64.94。而对于HBeAg， LYQ在所选剂量范围内对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率均低于50%，抑制作用不明显。结果见表2。表2  LYQ对抗原的抑制作用（略）
       4 讨论
          
       复方六月雪（CLYX）是通过长时期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方，主要由广西民间草药六月青、白花蛇舌草、栀子花根等组成，本课题组前期大量的实验研究表明，该方可有效地抑制鸭乙型肝炎病毒DNA 和HepG2.2.15细胞HBV DNA的复制［2，5，6］；无毒浓度的CLYX在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞HBV DNA的复制及HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）的分泌［3，7］；此外，CLYX对CCl4，AP，D-Gal所致小鼠急性化学性肝损伤均有明显的保护作用，并由此推测其保肝作用可能与诱导肝药酶有关［4］。
       
       中药复方成分非常复杂，其组方配伍多数是以某一味药为主其余为辅，诸药发挥协同治疗作用。为了能更好地保证CLYX疗效稳定性，本研究对该方中的六月青进行了抗HBV药效学研究，旨在筛选出该方有效活性部位，进而为下一步分离纯化有效化学成分，建立处方质控标准提供实验依据。
       
       本实验以HepG2.2.15细胞株作为对象，首先观察不同给药剂量的LYQ含药血清对HepG2.2.15细胞的毒性作用，以MTT法测定细胞的活力，按照Reed-Muench法计算得出：TC0=1.65 g·(kg·d)-1，TC50=11.56 g·(kg·d)-1，提示LYQ给药剂量≤1.65 g· (kg·d)-1时，其含药血清对HepG2.2.15细胞没有毒性。
       
       而对抗原抑制作用的实验发现，药物作用72 h后，给药剂量相当于0.213～1.7 g·(kg·d)-1的LYQ含药血清对HBsAg的抑制率在均高于50%，提示LYQ在体外具有显著的抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的作用（与细胞对照组比较P<0.05），且对HBsAg的抑制作用呈现剂量依赖性，经计算，对HBsAg半数有效给药剂量IC50=0.178 g· (kg·d)-1，治疗指数TI＝64.94。另外，LYQ对HepG2. 2. 15细胞分泌HBeAg的抑制率在所选剂量范围内均低于50%，抑制作用不明显。
       
       本实验初步表明LYQ含药血清体外有明显的抗HBV的作用，且毒性较低，并据此认为六月青应是复方六月雪中主要活性部位之一，值得进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］林兴，黄权芳，李江，等.广西民间药六月青的性状与显微鉴定［J］.中药材，2005，28（7）：541.
       
       ［2］张士军，林 军，蒋伟哲. 等.复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒DNA的抑制作用［J］.中药材，2007，30（2）：191.
       
       ［3］杨霞芳，张士军，黄春喜. 等.复方六月雪体外抗HBV的实验研究［J］.内科，2007，2（3）：317.
       
       ［4］苏洁寒，荣延平，蒋伟哲，等.复方六月雪对急性化学性肝损伤的保护作用［J］.广西医科大学学报，2003，20（4）：497.
       
       ［5］张士军,焦 杨,林 兴,等.复方六月雪对HepG2. 2. 15细胞HBV DNA的抑制作用［J］.中药药理与临床，2007，23(1)：59.
       
       ［6］张士军,林 军,焦 杨,等.复方六月雪含药血清对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制作用［J］.中药材，2006，29（12）：1338.
       
       ［7］张士军,黄春喜,谢海源,等.　复方六月雪对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用［J］.中国医院药学杂志，2007，27（6）：715.