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       【摘要】 
       目的建立山东不同品种玫瑰花药材的过氧化物酶同工酶鉴别方法。方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。结果19个品种的玫瑰花过氧化物酶同工酶分析，显现出谱带1～5条，其中D1带和D2带是玫瑰的基本谱带。结论山东产玫瑰花各品种过氧化物酶同工酶的谱型较多，品种之间有较明显的差异，可作为玫瑰花栽培品种鉴别的依据，为玫瑰花的规范化栽培提供了资料。
       【关键词】  玫瑰花；过氧化物酶同工酶；电泳；品种鉴别
       Analysis on Peroxidase Zymograms of Shandong Rugosa Rose
       LI Ming, TIAN Yongyun, GENG Jie
       1.Jinan Health School of Shandong Province, Jinan 250022, China; 2.Shandong Health Pharmaceutical Limited Company, Jinan 250022, China; 3.Chinese Medicine Hospital of Jinan, 250000, China
       Abstract：ObjectiveTo establish a Peroxidase isoenzyme(POD) method for identification of rugosa rose varieties in Shandong province.MethodsThe polyacrylamide gel electrophoresis method was applied. ResultsPeroxidase zymograms of the  19 species were analyzed.The results showed that there were one to five belts， of which D1 and D2 were basic. ConclusionThe significant difference of POD zymograms among rugosa rose varieties in Shandong can be used as a foundation， which will provide information for normalized cultivation.
       Key words： Rugosa rose；  Peroxidase isoenzyme；  Electrophoresis；  Variety identification
       
       玫瑰花是蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thumb.的干燥花蕾［1］，具有行气活血、开窍化淤、疏肝醒脾的功效。在我国已有二千多年的栽培历史，主产于山东、甘肃、安徽、浙江、河北、内蒙古等地［2］。山东作为玫瑰花的道地产区，汇集了当今玫瑰的主要品种。2005版《中国药典》对玫瑰花的质量标准收载的较少，并且在不少地区发现其混淆品现象。我们曾对山东玫瑰花的生产栽培情况进行了调查研究［3］，并对其进行了研究进展分析［4］、生药学研究［5］和挥发油的GCMS分析［6］。在此基础上，“山东玫瑰花的质量标准及方法研究”和“山东玫瑰花的生药学研究”课题组又利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对山东产19个品种的玫瑰花进行了过氧化物酶同工酶分析，为玫瑰花栽培品种的鉴别提供依据。
       1 材料与仪器
       1.1 药材
       采集各品种玫瑰花药材的茎尖、嫩芽，立即于4℃以下贮存备用。药物材料见表1。
       1.2 仪器
       DYYIII2稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），DYCZ28A型垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂），BCD225AG型电冰箱，电热恒温培养箱，离心机，JA1203型电子分析天平，真空干燥器，微量进样器，定量可调微量移液器，烧杯，量筒，刻度吸管，离心管，大培养皿，玻璃注射器，剪刀，研钵等。
       1.3 试剂分离胶缓冲液，分离胶贮液，浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮液，电极缓冲液，40%蔗糖溶液，过硫酸铵溶液，四甲基乙二胺，溴酚蓝指示剂，醋酸联苯胺显色液，脱色液等。所用生化试剂均为分析纯。
       2 方法
       2.1 样品液的制备取新鲜样品2～5 g，加适量稀释4倍的电极缓冲液，冰浴研磨成匀浆，冷冻离心机中3 000 r/min离心15 min，取其上清液，加入等体积蔗糖溶液，混匀，存于冰箱内备用。整个制备过程中保持样品温度不超过4℃。表1  药物材料（略）
       2.2 电泳槽的安装垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的由两个半槽组成的方形或长方形电泳槽。两半槽之间夹着凝胶模子，模子的两侧形成正负两个槽，供装电极缓冲液用。凝胶模子由两块玻璃装入一个塑料或硅酮橡胶的夹套内构成。
       
       玻璃板先用热的去污剂轻轻擦洗或用洗液浸泡，然后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，直立干燥，禁止用手接触洁净的玻璃板面。手持玻璃板两边，将两块玻璃板装入夹套内，然后垂直地放入半槽之间，长螺杆固定。上螺丝时，要按顺序逐步拧紧，均匀用力。电泳槽装好后，将琼脂熔化，趁 热注入正极槽的小池内，使在凝胶模子的下部凝结成约5 mm厚的琼脂层。
       2.3 分离胶与浓缩胶的制备将分离胶缓冲液、分离胶贮液、过硫酸铵溶液、蒸馏水按1∶2∶1∶4的比例（V/V）混合，配成分离胶液16ml；将浓缩胶缓冲液、浓缩胶贮液、过硫酸铵溶液、40%蔗糖溶液按1∶2∶1∶4的比例（V/V）混合，配成浓缩胶液4 ml。将配好的两种胶液及20～50 ml新鲜蒸馏水置真空干燥器内抽气20 min。
       
       分离胶液中加入四甲基乙二胺30 μl，混匀，立即缓缓注入已安装好的凝胶模子中，注意防止气泡。分离胶液上覆盖约3 mm后的蒸馏水，静置1 h以上，待分离胶与水层间界面清晰时，用滤纸条小心吸净水层。插上样品槽模板，使其底部距分离胶上层约1 cm。向浓缩胶液中加入四甲基乙二胺15 μl，混匀后注入凝胶模子中，静置30 min，浓缩胶变为乳白色，垂直向上小心取出样品槽模板。向正负电极槽内加入电极缓冲液共约800 ml，两槽内液面介于高低玻璃板之间。
        
       2.4 点样用微量注射器吸取样品液20～40μl，注入样品槽底部即可。
       2.5 电泳将电泳槽正负极分别与电泳仪的正负极相连，在负极槽电极缓冲液中加溴酚蓝指示剂1～2滴，打开电源，开始电泳。电泳采用稳流控制，开始时电流15 mA，当样品达到分离胶与浓缩胶界面时，增大电流至25 mA。为子止温度过高，可将电泳槽放在冰箱内，当溴酚蓝前沿行至距琼脂层约1 cm时，停止电泳，整个过程约需3 h。
       2.6 染色与保存打开电泳槽，取出胶板，标记前沿。将胶板浸于预先配好的显色液内，加几滴双氧水，5～10 min后出现清晰的蓝色谱带。
       3 结果
       3.1 泳动率的计算作为示踪指示剂的溴酚蓝在不同浓度的凝胶中，迁移速度基本相同，且分子筛效应小，近似于自由电泳，电泳过程中始终位于最前沿。按下列公式计算玫瑰花各样品的主要鉴别谱带泳动率。结果见表2。表2  山东玫瑰花的过氧化同工酶的Rf值（略）
       泳动率（Rf）=谱带泳动距离示踪指示剂泳动距离
       3.2 电泳图谱的测绘 根据各样品谱带的泳动率和谱带形态及出现的先后顺序，绘制电泳图谱。结果见图1。
       4 讨论
          
       电泳图谱显示，19个品种的玫瑰花过氧化物酶同工酶分析，其谱带从负极到正极，显现出谱带1～5条。其中16个品种具有D1带和D2带，品种间差异不明显，只有平阴四号、刺果、大红花3个品种缺少这两个谱带。结合形态学特征分析，平阴四号、刺果都具有蔓生的特点，是玫瑰与蔷薇的杂交变种；大红花具有枝条直立、花托杯状、多次开花的月季特征，是玫瑰与月季间某一品种的杂交变种。所以，作者认为玫瑰花过氧化物酶同工酶谱带中D1带和D2带是玫瑰的基本谱带，而玫瑰与其他蔷薇类杂交所产生的品种大多不具有此特征的谱带。当然，在品种的进化过程中也有例外，如紫枝便具有D1带和D2带，可能与其在杂合过程中更多地遗传了玫瑰的特征，这有待于进一步探讨研究。
       根据所绘电泳图谱，可以将玫瑰花过氧化同工酶谱带分为两大类9个谱型。第1类为缺少D1带和D2带的，分为3种谱型：①Ⅰ型，具有D5带和D6带如平阴四号。②Ⅱ型，只有D6带如刺果。③Ⅲ型，具有D3带、D4带和D6带如大红花。第2类为具有D1带和D2带的，分为6种谱型：①Ⅳ型，具有D6带的6个品种如平阴一号、平阴十一号、西胡一号、西胡二号、西胡三号、重瓣白。②Ⅴ型，具有D5带的4个品种如丰花、传统、紫枝、繁花。③Ⅵ型，具有D3带、D4带和D6带的2个品种如单瓣红、粉色。④Ⅶ型，具有D5带和D6带的2个品种如平阴三号、平阴十二号。⑤Ⅷ型，具有D3带和D4带的是平阴二号。⑥Ⅸ型，具有D3带和D5带的是单县玫瑰。
       
       过氧化酶同工酶分析在栽培品种的鉴定上更加准确、稳定，因为同工酶的结构差异主要来源于基因差异，利用它可以鉴别诸多基因变异。如生物的类别、品种的地理分布、演化关系［7］。总之，山东产玫瑰花各品种过氧化物酶同工酶的谱型较多，品种之间有较明显的差异，可以作为玫瑰花栽培品种鉴别的依据。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2005.
       
       ［2］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草，上册［M］.上海:上海科技出版社，1996：788.
       
       ［3］李明，彭艳丽，韩 莉，等.山东玫瑰花的生产情况调查［J］.山东中医杂志，2005，10（3）:196.
       
       ［4］李明，彭艳丽，韩 莉，等.中药玫瑰花的研究进展［J］.卫生职业教育，2007，25（8）:146.
       
       ［5］ 李明，彭艳丽，牟宗慧.山东玫瑰花的生药学研究［J］.中华中医药学刊，2008，26（1）:109.
       
       ［6］李明，彭艳丽，韩 莉，等.不同品种玫瑰花挥发油化学成分的GCMS分析［J］.中成药，2008，30（5）:104.
       
       ［7］黄寿松.几种植物中的过氧化物酶同工酶分析［J］.遗传，1980，2(3):7.