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       【摘要】 
       目的建立壳聚糖的含量测定新方法。方法利用分光光度法研究壳聚糖与水溶苯胺蓝的超分子反应条件，并建立分析方法。结果在pH 2.21时水溶苯胺蓝与壳聚糖发生了超分子褪色反应，所拟方法用于壳聚糖的测定，结果与溴甲酚绿法一致。结论所拟方法简单，快速，用于壳聚糖的测定结果准确、可靠。
       【关键词】  壳聚糖；水溶苯胺蓝；光度法
       壳聚糖(CTS)是自然界中唯一的碱性多糖，它是天然产物甲壳素经化学法处理脱乙酰基后的产物［1］，其安全无毒，因分子中含有丰富的亲水性氨基和羟基而具有良好的生物活性、生物相容性、易成膜性和配位性等而具有多种用途，应用范围广泛，因有保健作用而用作保健品。目前，测定壳聚糖含量的方法有茜素红S荧光熄灭法［2］、电化学法［3，4］和光度法［5～9］。但未见水溶苯胺蓝用于壳聚糖的测定。实验发现，在pH=2.21时，壳聚糖与水溶苯胺蓝能形成在610 nm处有最大褪色吸收的超分子复合物，详细研究了反应条件，建立了测定壳聚糖的新方法，用于保健胶囊中壳聚糖的测定，结果与溴甲酚绿法［5］一致。
       1 仪器与试剂
        722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS-210型万分之一的电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
        100 μg/ml的壳聚糖标准溶液：称取0.100 0 g壳聚糖，置于烧杯中，用0.5 mol/L的醋酸溶解，转入1 000 ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用；5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝溶液：称取水溶苯胺蓝0.184 4 g，置于烧杯中加水溶解，转入500 ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用；pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液［10］。
       2 方法
       
       准确移取适量100 μg/ml的壳聚糖标准溶液，置于10 ml的洁净比色管中，依次加入0.75 ml 5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝溶液，2.00 ml pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液，再用水定容至刻度线，摇匀。同时配制试剂空白溶液，以测定溶液为参比，用1 cm比色皿在波长610 nm处测定试剂空白的吸光度A。
       3 结果与讨论
       3.1 测试波长的选择
       准确移取100 μg/ml的壳聚糖标准溶液1.0 ml，置于10 ml的洁净比色管中，以下同“方法”项下操作,在波长为500～700 nm范围内测定溶液的吸光度，并绘制吸收光谱；同时配制试剂空白溶液，同样绘制吸收光谱，结果如图1所示，以水为参比时试剂空白水溶苯胺蓝的最大吸收波长在600 nm处，以水为参比的测定液的最大吸收波长在570 nm处，而以测定液为参比的相应试剂空白的最大吸收波长在610 nm处，说明壳聚糖与水溶苯胺蓝之间的反应是褪色反应，褪色的最大吸收波长与水溶苯胺蓝相比，仅红移10 nm。故选择610 nm为测试波长。
       3.2 pH的影响
       通常显色反应中酸度或pH是影响反应的重要因素之一。为此考察了pH值对反应的影响。对于在“方法”项下，其它条件不变，仅改变试液的缓冲溶液pH值，结果如图2所示，结果发现随着体系pH的升高，体系的吸光度逐渐变大；pH在1.89～2.36范围内体系的吸光度最大且稳定。当pH大于2.36是吸光度变小。故选择测试波长的选择pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液来控制体系的酸度。实验还发现pH=2.21  Britton-Robinson缓冲液用量在0.50～1.25 ml内时体系吸光度最大且稳定，故选用1.00 ml。
       3.3 试剂用量的影响
       水溶苯胺蓝作为壳聚糖的褪色标记试剂，它的加入量直接影响反应体系中超分子复合物的生成，对于100 μg/ml的壳聚糖来说，在“方法”项下，其它条件不变，仅改变水溶苯胺蓝溶液的用量，实验结果如图3所示，随着水溶苯胺蓝用量的增加，体系的吸光度逐渐增大；当其用量在0.75 ml时体系的吸光度最大且稳定；当其用量超过1.00 ml时体系吸光度反而变小。故选用0.75 ml 5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝溶液作为壳聚糖的标记试剂。
       3.4 时间的影响
       对于100 μg/ml的壳聚糖来说，在“方法”项下，其它条件不变，仅改变反应时间，结果表明，体系的吸光度稳定不受时间影响。
       3.5 工作曲线及线性范围
       在一组10 ml的比色管中，分别准确加入浓度为100 μg/ml的壳聚糖标准溶液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 ml，依次加入0.75 ml  5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝和1.00 ml pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液。以下按“方法”项下操作测定610 nm处的吸光度A，并绘制工作曲线，结果如图4所示，其工作曲线的回归方程为A=0.004 901C(C的单位为μg)+0.003 10,相关系数R=0.998 9，壳聚糖在10～120 μg/10 ml内服从比尔定律，测定的摩尔吸光系数ε为2.55×107 L·mol-1·cm-1。
       3.6 干扰物质的影响
       对于100 μg的壳聚糖来说，以相对误差在±5℅范围内，考察了一些干扰物质的影响，这些物质的允许量如下（以mg计）：K+，Fe2+，Mo(VI)，Cu2+，Al3+，Zn2+，Ba2+（5 mg）；氨基乙酸、维生素C、葡萄糖酸锌（4 mg）；Cr3+、Co2+、左旋肉碱、维生素E（1 mg）。说明使用本方法用于壳聚糖的测定具有较好的选择性。
       3.7 样品分析
       取含壳聚糖的胶囊10粒，将其内容物混合均匀，称重。准确称取壳聚糖样品（相当于100 mg壳聚糖），置于烧杯中，用0.5 mol/L的醋酸溶解后转入1 000 ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用。准确移取该样品溶液1.00 ml，置于10 ml的洁净比色管中，以下按“方法”项下操作测定610 nm处的吸光度A，平行测定11次，结果见表1，与溴甲酚绿法［5］所得结果一致。表1  样品分析结果（略）
       【参考文献】
         　　［1］那海秋，刘宝忠，张德智.壳聚糖的性质、制备及应用［J］.辽宁化工，2007，26(4):194.
       
       ［2］高贵珍,焦庆才,丁一磊,等.茜素红S荧光猝灭法测定壳聚糖含量［J］.光谱学与光谱分析,2003,23(5): 895.
       
       ［3］彭贞,丁文兵,陆光汉.电化学法测定壳聚糖粗制品中壳聚糖含量［J］.食品与发酵工业,2006,32(1):79.
       
       ［4］谭学才,麦智彬,邹小勇,等.壳聚糖与茜素红相互作用的电化学研究［J］.高等学校化学学报,2005,26(6):1055.
       
       ［5］郑铁生,王亚娜,宗爱萍.溴甲酚绿法测定壳聚糖的含量［J］.中国药科大学学报,2005，36(6):543.
       
       ［6］高贵珍,焦庆才,丁一磊,等.以分光光度法测定复方样品中的壳聚糖含量［J］.食品与发酵工业,2003,29(5):49.
       
       ［7］高贵珍,丁黎华,焦庆才,等.锌试剂分光光度法测定壳聚糖含量［J］.分析化学，2003,31(12):1479.
       
       ［8］陈伶俐,宗莉,庞瑞.分光光度法测定壳聚糖含量［J］.药物分析杂志,2005,25(5): 526.
       
       ［9］顾文秀,高建峰.壳聚糖的光度测定新方法［J］.分析试验室,2006,25(1):111.
       
       ［10］常文保，李克安.简明分析化学手册［M］.北京：北京大学出版社，1981:264.